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分子進化の歴史は20世紀初頭の「比較生化学」に始まりますが、分子進化の分野が本格的に発展したのは、分子生物学の台頭に伴い1960年代から1970年代にかけてのことです。タンパク質配列決定法の登場により、分子生物学者は配列比較に基づいて系統樹を作成し、相同配列間の違いを分子時計として用いて、最後の共通祖先からの経過時間を推定することが可能になりました。1960年代後半には、分子進化の中立説が分子時計の理論的基盤を提供しましたが、進化生物学者の多くは自然選択を進化変化の唯一の重要な原因とする汎選択説を強く支持していたため、分子時計と中立説の両方が議論の的となりました。1970年代以降、核酸配列決定法によって分子進化はタンパク質だけでなく、高度に保存されたリボソームRNA配列にも及ぶようになり、生命の初期の歴史を再概念化する基盤となりました。
1950年代と1960年代に分子生物学が台頭する以前は、少数の生物学者が、種間の生化学的差異を利用して進化を研究する可能性を探っていた。 アルフレッド・スターテバントは1921年に染色体逆位の存在を予測し、ドブジャンスキーとともに、多糸染色体の交雑によって観察された染色体逆位の蓄積から、17のショウジョウバエ Pseudo-obscura 系統に関する最初の分子系統樹の 1 つを構築した。[ 1 ]アーネスト・ボールドウィンは1930年代から比較生化学に幅広く取り組み、マルセル・フロルキンは1940年代に分子および生化学的特徴に基づいて系統樹を構築する技術を開拓した。しかし、生物学者が分子進化の定量的研究のための生化学的データを生成する技術を開発したのは1950年代になってからだった。[ 2 ]
最初の分子系統学研究は、免疫学的アッセイとタンパク質の「フィンガープリンティング」法に基づいていた。ジョージ・ナトールの免疫学的方法を基に、アラン・ボイデンは1954年から新しい技術を開発し、1960年代初頭にはカーティス・ウィリアムズとモリス・グッドマンが免疫学的比較を用いて霊長類の系統発生を研究した。ライナス・ポーリングとその弟子たちなどは、新たに開発された電気泳動とペーパークロマトグラフィーの組み合わせを、消化酵素による部分的な消化を受けたタンパク質に適用し、独自の二次元パターンを作成することで、相同タンパク質の詳細な比較を可能にした。[ 3 ]
1950年代から、エルンスト・マイヤーやチャールズ・シブリーといった数名の博物学者も分子生物学的手法を試みた。マイヤーはすぐにペーパークロマトグラフィーに幻滅したが、シブリーは卵白タンパク質に電気泳動法を適用して鳥類の分類上の問題を解決し、すぐにDNAハイブリダイゼーション技術を併用した。これが分子系統学に基づく長いキャリアの始まりとなった。[ 4 ]
こうした初期の生化学的手法は生物学界で渋々受け入れられたものの、進化論や集団遺伝学の主要な理論的問題にはほとんど影響を与えなかった。しかし、分子生物学が遺伝子の物理的・化学的性質をより深く解明するにつれて、状況は変化していくことになる。
1950年代に分子生物学が本格的に発展し始めた頃、近親交配系統を異系交配させたときに観察される適応度の増加であるヘテロシスの原因について、古典的/バランス論争という長期にわたる議論があった。1950年、ジェームズ・F・クロウは、1937年にJBSホールデンが最初に提唱したパラドックスに基づいて、 2つの異なる説明（後に古典的立場とバランス的立場と呼ばれる）を提示した。それは、有害な突然変異が集団の平均適応度に及ぼす影響は、突然変異の頻度（各突然変異によって引き起こされる害の程度ではない）のみに依存するというものである。なぜなら、より有害な突然変異は自然選択によってより早く排除されるのに対し、害の少ない突然変異は集団内に長く残るからである。HJミュラーはこれを「遺伝的負荷」と呼んだ。[ 5 ]
ミュラーは、放射線が人体集団に及ぼす影響への懸念から、ヘテロシスは主に有害なホモ接合劣性対立遺伝子の結果であり、その影響は異なる系統を交配すると隠蔽されると主張した。これが優性仮説であり、ドブジャンスキーが古典的立場と呼んだものの一部である。したがって、電離放射線とそれに伴う突然変異は、被曝した世代で死亡や病気が起こらなくても、かなりの遺伝的負荷を生み出し、突然変異がない場合、自然選択は徐々にホモ接合性のレベルを高めることになる。ブルース・ウォレスは、 JCキングと共同で、過剰優性仮説を用いてバランス立場を発展させた。これは、過剰優性（遺伝子のヘテロ接合状態がホモ接合状態よりも適応度が高い場合）により大きな余地を残した。この場合、ヘテロシスは単にヘテロ接合体優位の発現の増加の結果である。優性遺伝子座が一般的であれば、自然選択によって高いレベルのヘテロ接合性が生じ、突然変異を誘発する放射は、優性による適応度の増加を実際に促進する可能性がある。（これはドブジャンスキーの見解でもあった。）[ 6 ]
議論は1950年代を通して続き、次第に集団遺伝学の中心的な焦点となった。1958年のウォレスによるショウジョウバエの研究では、放射線誘発突然変異が以前はホモ接合体であったハエの生存率を高めることが示唆され、ヘテロ接合体優位と平衡位置の証拠となった。ウォレスは、自然のショウジョウバエ集団の遺伝子座の50%がヘテロ接合体であると推定した。木村元夫によるその後の数学的解析は、1950年にクロウが示唆したことを裏付けた。すなわち、超優性遺伝子座がまれであっても、遺伝的変異の不均衡な量の原因となり得るということである。したがって、木村と彼の師であるクロウは古典的な立場に立った。クロウと木村のさらなる共同研究は、無限対立遺伝子モデルにつながり、これは集団サイズ、突然変異率、および突然変異対立遺伝子が中立、超優性、または有害であるかどうかに基づいて、集団で予想される異なる対立遺伝子の数を計算するために使用できる。したがって、無限対立遺伝子モデルは、ヘテロ接合度のレベルの正確な値が見つかれば、古典的な立場とバランスの立場のどちらを選択するかを決定する潜在的な方法を提供する。[ 7 ]
1960年代半ばまでに、生化学と分子生物学の技術、特にタンパク質電気泳動法によって、自然集団におけるヘテロ接合度を測定する方法が確立され、古典的/バランス論争を解決する手段が見出された。1963年、ジャック・L・ハビーはショウジョウバエのタンパク質変異に関する電気泳動研究を発表した[ 8 ]。その後まもなく、ハビーはリチャード・レウォンティンと共同研究を開始し、ハビーの方法を自然集団におけるヘテロ接合遺伝子座の割合を測定することで、古典的/バランス論争に適用した。1966年に発表された彼らの2つの画期的な論文は、ショウジョウバエのヘテロ接合度が有意に高いこと（平均12%）を明らかにした[ 9 ] 。しかし、これらの発見は解釈が難しいことが判明した。ほとんどの集団遺伝学者（ハビーとレウォンティンを含む）は、広範囲にわたる中立突然変異の可能性を否定し、選択を伴わない説明は主流の進化生物学にとって忌まわしいものであった。ハビーとルウォンティンは、分離負荷が大きくなるため、ヘテロ接合体優位を主な原因として除外したが、批評家たちは、この発見は実際には過剰優性仮説によく合致すると主張した。[ 10 ]
進化生物学者が分子生物学へと徐々に研究領域を広げていく一方で、分子生物学者は急速に進化へと注目を移していった。
1951年から1955年にかけてインスリンを用いてタンパク質配列決定の基礎を確立した後、フレデリック・サンガーとその同僚は1956年にインスリン配列の種間比較を限定的に発表した。フランシス・クリック、チャールズ・シブリーらは、生物学的配列を用いて系統樹を構築する可能性を認識していたが、そのような配列はまだほとんど入手できなかった。1960年代初頭までに、タンパク質配列決定の技術は、相同アミノ酸配列の直接比較が可能なレベルまで進歩した。[ 11 ] 1961年、エマニュエル・マルゴリアシュとその共同研究者らは、ウマのシトクロム c（インスリンよりも長く、より広く分布しているタンパク質）の配列を完成させ、その後まもなく他の多くの種でも同様の配列が決定された。
1962年、ライナス・ポーリングとエミール・ツッカーカンドルは、相同タンパク質配列間の差異の数を用いて分岐からの時間を推定することを提案した。このアイデアは、ツッカーカンドルが1960年か1961年頃に思いついたものであった。これは、ポーリングが長年研究対象としてきたヘモグロビンから始まった。ヘモグロビンはウォルター・シュローダーによって配列決定されていた。この配列は、脊椎動物の系統発生に関する定説を裏付けるだけでなく、（1957年に初めて提唱された）単一の生物内の異なるグロビン鎖も共通の祖先タンパク質に由来するという仮説も支持していた。[ 12 ] 1962年から1965年にかけて、ポーリングとツッカーカンドルはこのアイデアを洗練させ、詳細に説明し、彼らはこれを分子時計と名付けた。エミール・L・スミスとエマニュエル・マルゴリアシュは、この分析をシトクロム cにまで拡張した。初期の分子時計の計算は、古生物学的証拠に基づく確立された分岐時間とかなりよく一致した。しかし、分子時計の本質的な考え方、つまり個々のタンパク質は種の形態進化とは無関係に一定の速度で進化するという考え方は、非常に刺激的であった（ポーリングとズッカーカンドルが意図したとおり）。[ 13 ]
1960年代初頭から、分子生物学は進化生物学の伝統的な中核に対する脅威とみなされるようになった。確立された進化生物学者、特に1930年代から1940年代にかけての現代進化総合説の創始者であるエルンスト・マイヤー、テオドシウス・ドブジャンスキー、GG・シンプソンらは、分子アプローチ、特に自然選択との関連性（あるいはその欠如）に関して極めて懐疑的であった。分子進化全般、特に分子時計は、進化の因果関係を探るための根拠をほとんど提供しなかった。分子時計仮説によれば、タンパク質は環境によって決定される選択力とは本質的に独立して進化する。これは当時主流であった汎選択説とは大きく矛盾していた。さらに、ポーリング、ツッカーカンドル、その他の分子生物学者は、「情報高分子」（DNA、RNA、タンパク質）が進化を含むすべての生物学的プロセスにとって重要であると、ますます大胆に主張するようになった。[ 14 ]進化生物学者と分子生物学者の間の争い――それぞれのグループが自分たちの分野を生物学全体の中核として主張していた――は、後にエドワード・O・ウィルソンによって「分子戦争」と名付けられた。ウィルソンは、1950年代後半から1960年代にかけて、若い分子生物学者が生物学科を支配する様子を直接体験した。[ 15 ]
1961年、メイアは機能生物学（近因を考察し、「どのように」という問いを立てる）と進化生物学（究極原因を考察し、「なぜ」という問いを立てる）の明確な区別を主張し始めた[ 16 ]。彼は、学問分野と個々の科学者は機能的側か進化的側かに分類でき、生物学への2つのアプローチは相補的であると主張した。メイア、ドブジャンスキー、シンプソンらはこの区別を用いて、資金と大学の支援をめぐる競争で分子生物学や関連分野に急速に後れを取っていた生物個体生物学の継続的な重要性を主張した[ 17 ] 。このような状況下で、ドブジャンスキーは1964年の論文で、分子生物学の脅威に直面して生物個体生物学の重要性を主張し、「生物学において進化の光なしには意味をなさないものはない」という有名な声明を初めて発表した。ドブジャンスキーは分子生物学の分野を「デカルト的」（還元主義的）と、生物個体生物学の分野を「ダーウィン的」と特徴づけた。[ 18 ]
メイアとシンプソンは、分子進化が議論された初期の会議の多くに出席し、分子時計の過度に単純化されたアプローチを批判した。ランダムな突然変異と遺伝的浮動によって引き起こされる均一な遺伝子変化率に基づく分子時計は、進化の速度の変動や、環境によって引き起こされる適応プロセス（適応放散など）といった、進化総合説の主要な発展と相容れないように思われた。1962年のウェンナー・グレン会議、1964年のベルギーのブルージュで開催された血液タンパク質の進化に関するコロキウム、そして1964年のラトガース大学での進化する遺伝子とタンパク質に関する会議で、彼らは分子生物学者や生化学者と直接交流し、進化の研究が新たな分野に広がるにつれて、進化におけるダーウィン的説明の中心的な位置を維持しようとした。[ 19 ]
分子進化とは直接関係はないものの、1960年代半ばには、ジョージ・C・ウィリアムズの『適応と自然選択』（1966年）をきっかけに、遺伝子中心の進化観が台頭した。選択の単位、特に集団選択をめぐる論争は、進化の理論的基盤として、（生物全体や集団ではなく）個々の遺伝子への注目を高めることにつながった。しかし、遺伝子への注目が高まったからといって、分子進化への注目が高まったわけではない。実際、ウィリアムズや他の進化論者が提唱した適応主義は、分子進化論者が研究する一見非適応的な変化をさらに軽視する結果となった。
分子進化の知的脅威は、1968年に木村元夫が分子進化の中立説を提唱したことでより明確になった。[ 20 ]木村は、 入手可能な分子時計研究（多種多様な哺乳類のヘモグロビン、 哺乳類と鳥類のシトクロムc、ウサギとウシのトリオースリン酸デヒドロゲナーゼ）に基づいて、DNA置換の平均速度を2800万年あたり300塩基対（100アミノ酸をコード）あたり1塩基対の変化と計算した。哺乳類のゲノムの場合、これは1.8年に1回の置換速度を示しており、置換の大部分が選択的に中立でない限り、持続不可能なほど高い置換負荷が生じることになる。木村は、中立突然変異は非常に頻繁に起こると主張し、この結論はタンパク質ヘテロ接合性の電気泳動研究の結果と一致する。木村はまた、遺伝的浮動に関する以前の数学的研究を応用して、自然選択がない場合でも中立突然変異が固定される仕組みを説明した。彼はすぐにジェームズ・F・クロウにも中立対立遺伝子と遺伝的浮動の潜在的な力について納得させた。[ 21 ]
木村の理論は、ネイチャー誌への手紙で簡単に説明されただけであったが、その後すぐにジャック・L・キングとトーマス・H・ジュークスによるより詳細な分析が発表され、彼らはこのテーマに関する最初の論文を「非ダーウィン進化」と題した。[ 22 ] キングとジュークスは、非中立的な変化の場合の置換率とそれに伴う遺伝的負荷の推定値をはるかに低くしたが、遺伝的浮動によって引き起こされる中立突然変異は実在し、重要であるという点では一致していた。個々のタンパク質について観察された比較的一定の進化速度は、中立置換を想定せずに簡単に説明することはできなかった（GGシンプソンとエミル・スミスは試みたが）。ジュークスとキングはまた、アミノ酸の頻度と各アミノ酸をコードする異なるコドンの数との間に強い相関関係があることを発見した。これは、タンパク質配列の置換が主にランダムな遺伝的浮動の産物であることを示唆していた。[ 23 ]
キングとジュークスの論文は、特にその挑発的なタイトルから、主流のネオダーウィニズムへの直接的な挑戦と見なされ、分子進化と中立説を進化生物学の中心に据えた。この論文は、分子時計のメカニズムと、進化速度と機能的重要性との関係など、分子進化のより深い問題を探求するための理論的基盤を提供した。中立説の台頭は、進化生物学と分子生物学の統合を象徴するものであったが、それは不完全なものであった。[ 24 ]
1971年、エミール・ツッカーカンドルをはじめとする分子進化論者たちは、より確固たる理論的基盤に基づいて研究を進め、学術誌『Journal of Molecular Evolution』を創刊した。
中立説に対する批判的な反応がすぐに現れたことで、中立説と自然選択説の論争が始まった。簡単に言えば、自然選択説論者は、分子レベルにおいても自然選択こそが進化の主要な、あるいは唯一の原因であると考えていたのに対し、中立説論者は、中立的な突然変異は広く存在し、遺伝的浮動がタンパク質の進化において重要な要因であると主張した。木村は中立説の最も著名な擁護者となり、その後の彼の研究の中心は中立説となった。太田とともに、彼は議論の焦点を、有限集団における遺伝的浮動による新たな突然変異の固定率、一定のタンパク質進化速度の重要性、そして生化学者や分子生物学者が提唱したタンパク質進化における機能的制約へと移した。木村は当初、古典的/平衡論争における古典的立場（非中立突然変異の結果として高い遺伝的負荷を予測する）の発展として中立理論を部分的に展開したが、中立突然変異がなければ分離負荷が不可能に高くなるという当初の主張（多くの選択論者、さらには同胞の中立論者であるキングとジュークスもこれを否定した）を徐々に軽視するようになった。[ 25 ]
1970年代から1980年代初頭にかけて、選択論者と中立論者の両方とも、未知のパラメーターに異なる値を仮定することで、自然集団で観察される高いヘテロ接合度を説明することができた。議論の初期段階で、木村の教え子である太田智子は、厳密には中立ではないが、ほぼ中立である突然変異にとって重要な、自然選択と遺伝的浮動の相互作用に注目した。このような場合、選択は浮動と競合する。わずかに有害な突然変異のほとんどは自然選択または偶然によって排除され、一部は浮動によって固定される。中立理論の数学的手法と古典的なモデルを組み合わせた方程式で記述されるこの種の突然変異の挙動は、太田のほぼ中立的な分子進化理論の基礎となった。[ 26 ]
1973年、太田智子はNature誌に短い手紙を発表し[ 27 ]、分子レベルでのほとんどの突然変異は厳密に中立ではなく、わずかに有害であるという理論を、幅広い分子レベルの証拠が支持していることを示唆した。分子進化論者は、タンパク質の進化速度（分子時計と一致する）は世代時間とほぼ無関係である一方、非コードDNAの分岐速度は世代時間に反比例することを発見していた。集団サイズは一般的に世代時間に反比例することに注目し、太田智子は、ほとんどのアミノ酸置換はわずかに有害であるのに対し、非コードDNA置換はより中立的であると提唱した。この場合、小さな集団で予想されるタンパク質のより速い中立進化速度（遺伝的浮動による）は、より長い世代時間によって相殺される（逆もまた同様）が、世代時間が短い大きな集団では、非コードDNAはより速く進化する一方、タンパク質の進化は選択によって遅延する（これは大きな集団では浮動よりも重要である）。[ 28 ]
それから1990年代初頭までの間、分子進化の多くの研究では、有害な突然変異による集団の適応度への負の影響が、突然変異が固定に達すると元の値に戻るという「シフトモデル」が用いられた。1990年代初頭、太田は有益な突然変異と有害な突然変異の両方を含む「固定モデル」を開発し、集団全体の適応度の人工的な「シフト」は不要とした。[ 29 ] しかし太田によれば、ほぼ中立理論は、高速DNAシーケンスの出現後に盛んになった広範な分子系統学研究にとって数学的に単純な中立理論のために、1980年代後半にはほとんど支持されなくなった。1990年代に、より詳細な系統学研究が強い選択を受けるゲノム領域と弱い選択を受けるゲノム領域の進化を比較し始めると、ほぼ中立理論と選択と浮動の相互作用が再び重要な研究の焦点となった。[ 30 ]
分子進化の初期の研究は、配列決定が容易なタンパク質と比較的最近の進化史に焦点を当てていたが、1960年代後半には、一部の分子生物学者が高度に保存された核酸配列を研究することで、生命の樹の基部へとさらに踏み込んでいった。 遺伝暗号とその起源に関する初期の研究を行っていた分子生物学者カール・ウーズは、小サブユニットリボソームRNAを用いて、形態学的類似性ではなく遺伝学的類似性に基づいて細菌を再分類し始めた。研究は当初ゆっくりと進んだが、1970年代と1980年代に新しい配列決定法が開発されるにつれて加速した。1977年までに、ウーズとジョージ・フォックスは、メタン生成菌などの一部の細菌は、ウーズの系統学的研究の基礎となったrRNAユニットを欠いていると発表した。彼らは、これらの生物は実際には従来の細菌やいわゆる高等生物とは十分に異なっており、独自の界を形成していると主張し、それを古細菌と名付けた。当初は物議を醸し（1990年代後半にも再び異議を唱えられた）、ウーゼの研究は、古細菌、細菌、真核生物という現代の3ドメインシステムの基礎となった（1960年代に登場した5ドメインシステムに取って代わった）。[ 31 ]
微生物の系統発生に関する研究は、分子進化を細胞生物学や生命の起源研究に近づけた。古細菌間の違いは、生命の初期の歴史におけるRNAの重要性を示唆した。遺伝暗号に関する研究において、ウーズは、RNAベースの生命が現在のDNAベースの生命の形態に先行していたことを示唆しており、彼以前にも同様の考えを持っていた研究者が複数いた。この考えは、後にウォルター・ギルバートによって「RNAワールド」と呼ばれることになる。1990年代のゲノム研究は、多くの場合、rRNAベースの結果と矛盾する系統発生を生み出し、異なる分類群間での広範な水平遺伝子伝達の認識につながった。オルガネラで満たされた真核生物の細胞内共生起源の可能性と組み合わせると、これは、共通祖先という従来の用語では説明できない、はるかに複雑な生命の起源と初期の歴史像を示唆している。[ 32 ]