フローサイトメトリー

フローサイトメトリー

サンプル注入チューブを備えたフローサイトメーター。
分類	サイトメトリー
分析対象物	細胞または粒子
その他のテクニック
関連している	コールターカウンター

フローサイトメトリー（FC ）は、細胞または粒子の集団の物理的および化学的特性を検出および測定するために使用される技術です。^{[1] [2] [3] [4]}

このプロセスでは、細胞または粒子を含むサンプルを液体に懸濁し、フローサイトメーター装置に注入します。サンプルは、理想的には 1 細胞ずつレーザー光線を通過できるように焦点が絞られ、散乱光は細胞とその成分に特有のものになります。細胞は蛍光マーカーで標識されることが多く、光が吸収されてから波長帯で放出されます。数万個の細胞を迅速に検査でき、収集されたデータはコンピューターで処理されます。^[5]

フローサイトメトリーは、基礎研究、臨床診療、臨床試験で日常的に使用されています。フローサイトメトリーの用途には以下が含まれます。

• 細胞カウント
• 細胞選別
• 細胞の特性と機能の決定
• 微生物の検出
• バイオマーカー検出
• タンパク質工学検出
• 血液がんなどの健康障害の診断
• ゲノムサイズの測定

フローサイトメトリー分析装置は、サンプルから定量化可能なデータを提供する装置です。フローサイトメトリーを使用するその他の装置には、光学特性に基づいて対象の細胞を物理的に分離して精製する細胞選別装置などがあります。

コールター原理を使用した最初のインピーダンスベースのフローサイトメトリー装置は、1953年にウォレス・H・コールターに付与された米国特許第2,656,508号で開示された。マック・フルワイラーは、今日のフローサイトメーター、特にセルソーターの前身を発明した。^{[6]フルワイラーは1965年にこれを開発し、}サイエンス誌に発表した。^[7]最初の蛍光ベースのフローサイトメトリー装置（ICP 11）は、1968年にミュンスター大学のヴォルフガング・ゲーデによって開発され、1968年12月18日に特許が申請され^{[8] 、1968/69年にドイツの開発・製造業者であるパルテックによって}ゲッティンゲンのPhywe AGを通じて初めて商品化された。当時は、他の科学者の間では蛍光法よりも吸収法が依然として広く好まれていた。^[9]その後すぐに、フローサイトメトリー機器が開発され、バイオ/フィジックスシステムズ社（後のオーソダイアグノスティクス社）のサイトフルオログラフ（1971年）、パルテック社のPAS 8000（1973年）、ベクトンディキンソン社の最初のFACS（蛍光活性化細胞選別）機器（1974年）、パルテック/フィウェ社のICP 22（1975年）、コールター社のEpics （1977/78年）などが開発されました。特許取得済みのマイクロ流体「ラボオンチップ」をベースにした最初のラベルフリー高周波インピーダンスフローサイトメーターであるAmpha Z30は、Amphasys社によって導入されました（2012年）。^[要出典]

蛍光フローサイトメトリー技術の元々の名前は「パルスサイトフォトメトリー」（ドイツ語：Impulszytophotometrie）で、蛍光フローサイトメトリーに関する最初の特許出願に基づいていました。最初の蛍光フローサイトメーターの導入（1968年）から8年後の1976年にペンサコーラ（フロリダ州）で開催された第5回アメリカ工学財団自動細胞学会議で、「フローサイトメトリー」という名前を一般的に使用することが合意され、この用語はすぐに普及しました。^[10]

現代のフローサイトメーターは、1 秒間に何千もの粒子を「リアルタイム」で分析することができ、細胞選別装置として構成されていれば、特定の光学特性を持つ粒子を同様の速度で能動的に分離および隔離することができます。フローサイトメーターは顕微鏡に似ていますが、細胞の画像を生成する代わりに、フローサイトメトリーは細胞ごとに特定の光学パラメータを高スループットで自動的に定量化します。固形組織を分析するには、まず単一細胞懸濁液を準備する必要があります。^{[引用が必要]}

フローサイトメーターには、フローセル、測定システム、検出器、増幅システム、および信号分析用のコンピュータという 5 つの主要コンポーネントがあります。フローセルには液体ストリーム (シース液) があり、これが細胞を運び、整列させて、細胞が 1 列になって光線を通過し、感知します。測定システムでは、通常、インピーダンス (または伝導率) の測定と光学系 (ランプ (水銀、キセノン)、高出力水冷レーザー (アルゴン、クリプトン、色素レーザー)、低出力空冷レーザー (アルゴン (488 nm)、赤色 HeNe (633 nm)、緑色 HeNe、HeCd (UV))、ダイオード レーザー(青、緑、赤、紫) が使用され、光信号が生成されます。検出器とアナログ - デジタル変換 (ADC) システムは、前方散乱光 (FSC) と側方散乱光 (SSC) のアナログ測定値、および色素固有の蛍光信号を、コンピュータで処理できるデジタル信号に変換します。増幅システムは線形または対数型にすることができます。^[要出典]

フローサイトメーターを使用してサンプルからデータを収集するプロセスは、「取得」と呼ばれます。取得は、フローサイトメーターに物理的に接続されたコンピュータと、サイトメーターとのデジタル インターフェイスを処理するソフトウェアによって行われます。ソフトウェアは、テスト対象のサンプルのパラメータ (電圧、補正など) を調整できるほか、サンプル データを取得しながら初期サンプル情報を表示して、パラメータが正しく設定されていることを確認することもできます。初期のフローサイトメーターは、一般的には実験装置でしたが、技術の進歩により、臨床目的と研究目的の両方で幅広く使用できるようになっています。これらの開発により、機器、分析ソフトウェア、および蛍光標識 抗体などの取得に使用される試薬の市場がかなり拡大しました。

現代の機器には通常、複数のレーザーと蛍光検出器が搭載されています。市販機器の現在の最高記録は、10 個のレーザー^{[11]と 30 個の蛍光検出器です[12]}。レーザーと検出器の数を増やすと、複数の抗体標識が可能になり、表現型マーカーによってターゲット集団をより正確に識別できます。一部の機器では、個々の細胞のデジタル画像を撮影して、細胞内または細胞表面の蛍光信号の位置を分析することもできます。^{[引用が必要]}

フローサイトメーターで細胞の光学特性を正確に測定するには、細胞が集束レーザービームの中心を均一に通過する必要があります。^{[13] [14] [15]}流体システムの目的は、細胞をレーザービームを通して機器全体に1つずつ移動させることです。細胞選別機能を備えたフローサイトメーターの流体システムは、選別された細胞を収集チューブまたはウェルに運ぶためにもストリームを使用します。^[13]

液体ジェット内の細胞を正確に位置決めするために、ほとんどのサイトメーターでは流体力学的フォーカスが使用されています。^{[13] [14]}懸濁液中の細胞は、外側のシース液で囲まれた機器に入ります。サンプルコアはシース液の中心に維持されます。サンプル入力速度、つまり細胞がレーザー検査装置に流れる速度は、サンプルコアに対するシース液の圧力によって制御できます。最適な条件下では、中央の流体ストリームとシース液は混ざりません。^[要出典]

音響フォーカス技術は、一部のフローサイトメーターで流体力学的フォーカスをサポートするために使用されています。^{[13] [15]}音波（> 2 MHz）は、シース液に導入する前にサンプルを事前にフォーカスします。次に、事前にフォーカスされたサンプルは流体力学的コアに注入され、機器内を流れます。これにより、サンプル入力速度が高い場合のデータ精度が向上する可能性があります。

蛍光体から放出される光は波長のスペクトル内にあるため、複数の蛍光体を組み合わせると重複が生じる可能性があります。特異性を高めるために、光学フィルターと二色性ミラーを使用して光をフィルタリングし、光電子増倍管(PMT) やアバランシェフォトダイオード(APD)などの検出器に移動します。^[13]光学フィルターは、バンドパス (BP)、ロングパス (LP)、またはショートパス (SP) フィルターとして設計されています。ほとんどのフローサイトメーターは、二色性ミラーとバンドパスフィルターを使用して、光スペクトルの特定のバンドを選択します。

スペクトルフローサイトメトリーは、プリズムまたは回折格子を使用して、マーカーの放出光を検出器アレイ全体に分散させます。^{[13] [16]}これにより、各粒子からの全スペクトルを測定できます。測定された単一細胞からのスペクトルは、その後、使用されたすべての染料の参照スペクトルと自己蛍光スペクトルを使用して分離されます。これにより、より幅広いパネル設計と新しい生物学的マーカーの適用が可能になります。^{[引用が必要]}

イメージングフローサイトメトリー（IFC）は、細胞のマルチチャンネル画像を撮影します。^{[13] [17]}イメージングプラットフォームで使用される検出器には、個々の細胞の画像を撮影するために、電荷結合素子（CCD）または相補型金属酸化物半導体（CMOS）が搭載されています。

各蛍光色素は幅広い蛍光スペクトルを持っています。複数の蛍光色素を使用すると、蛍光色素間の重なりが生じることがあります。この状況はスペクトルの重なりと呼ばれ、補正する必要があります。たとえば、FITC と PE の発光スペクトルでは、フルオレセインから放出された光が PE に使用されるフィルターを通過するときに同じ波長で重なります。このスペクトルの重なりは、PE 信号から FITC 信号の一部を除去するか、その逆を行うことで補正されます。このプロセスは色補正と呼ばれ、蛍光色素をパーセンテージとして計算して測定します。^[18]

補正とは、マルチパラメータフローサイトメトリーデータのスペクトルの重なりを補正する数学的プロセスです。蛍光色素は広範囲のスペクトルを持つ可能性があるため、重なり合うことがあり、データ分析中に混乱が生じるという望ましくない結果を引き起こします。この重なりはスピルオーバーと呼ばれ、スピルオーバー係数で定量化されますが、通常、特定の蛍光色素の検出器が別の蛍光色素からの波長の大きなピークを測定することによって発生します。この補正を行うために最もよく使用されるのは線形代数です。^[18]

一般的に、1 つ以上のパラメータのグラフが表示される場合、他のパラメータが表示されている分布に寄与していないことを示すためです。特に、2 倍以上のパラメータを使用する場合、この問題はより深刻になります。現在、多次元パラメータを効率的に表示するツールは発見されていません。セル間の区別を確認するには、補正が非常に重要です。

^[要出典]

フローサイトメーターによって生成されたデータは、ヒストグラムを作成するために一次元でプロットすることも、2次元ドットプロット、さらには3次元でプロットすることもできます。これらのプロット上の領域は、一連のサブセット抽出（「ゲート」と呼ばれる）を作成することによって、蛍光強度に基づいて順次分離できます。特に血液学に関連して、診断および臨床目的のために特定のゲーティングプロトコルが存在します。個々の単一細胞は、狭く焦点を絞ったレーザービームを通過する「飛行時間」（「パルス幅」とも呼ばれる）によって、細胞ダブレットまたはそれ以上の集合体と区別されることがよくあります^[19]

プロットは対数スケールで作成されることが多い。異なる蛍光色素の発光スペクトルは重なり合うため、^{[20] [21]}検出器での信号は電子的にも計算的にも補正する必要がある。フローサイトメーターを使用して蓄積されたデータはソフトウェアを使用して分析できる。データが収集されると、フローサイトメーターに接続したままにする必要はなく、分析はほとんどの場合別のコンピューターで実行される。^{[引用が必要]}これは、これらのマシンの使用需要が高いコア施設では特に必要である。^{[引用が必要]}

計算手法を用いた自動集団同定に関する最近の進歩は、従来のゲーティング戦略に代わる方法を提供している。自動同定システムは、希少集団や隠れた集団の発見に役立つ可能性がある。代表的な自動化手法としては、免疫学データベースおよび分析ポータル（ImmPort）のFLOCK ^{[22] 、 [23 ]、} BioconductorのSamSPECTRAL ^[24]およびflowClust ^{[25] [26] [27]}、GenePatternのFLAME ^[28]などがある。T分布確率的近傍埋め込み（tSNE）は、次元削減を実行し、複雑な多次元データを2次元「マップ」で視覚化できるように設計されたアルゴリズムである。^[29]共同作業の結果、FlowCAP（フローサイトメトリー：集団同定手法の批判的評価） ^[30]と呼ばれるオープンプロジェクトが生まれ、フローサイトメトリーデータのクラスタリング手法を客観的に比較・評価する方法を提供し、これらの手法の適切な使用と適用に関するガイダンスを確立している。

蛍光マイナス 1 (FMO) コントロールは、細胞を複数の蛍光色素で同時に染色するマルチカラー パネルを作成する際のデータ解釈に重要です。FMO コントロールは、特定のチャネルでの蛍光スピルオーバーの測定を提供し、補正を可能にします。FMO コントロールを生成するには、サンプルをテスト対象の蛍光色素を除くすべての蛍光色素で染色します。つまり、4 つの異なる蛍光色素を使用している場合、FMO コントロールにはそのうちの 3 つだけを含める必要があります (例: 蛍光色素 – A、B、C、D、FMO – ABC_、AB_D、A_CD、_BCD)。^{[引用が必要]}

細胞選別は、特定の物理的特性の有無に基づいて細胞集団を精製する方法である。^{[13] [15] [31]}選別機能を備えたフローサイトメーターでは、細胞の大きさ、形態、タンパク質発現などのパラメータを使用して細胞を検出し、その後、液滴技術を使用して細胞を選別し、実験後の使用のためにサブセットを回収する。^{[13] [15]}

最初のプロトタイプの細胞選別機は、1965年に物理学者マック・J・フルワイラーによって、コールター体積センサーと新しく発明されたインクジェットプリンターを組み合わせてロスアラモス国立研究所（LANL）で作られました。[32] 生細胞細胞選別機または蛍光活性化細胞選別機（FACS）[ a ^]はレン・ヘルツェンバーグによって開発され、彼はその後、その独創的な研究により2006年に京都賞を受賞しました。^[34]

フローサイトメトリー細胞選別装置には、フローサイトメトリー分析装置とは異なり、収集システムがあります。収集プロセスは、サンプルがシース液の流れに注入され、シース液がフローセルを通過してレーザーで捕捉されるときに開始されます。^[35] 次に、流れは細胞を振動ノズルに運び、ほとんどが 1 個の細胞を含むか、細胞を含まない液滴を生成します。流れが液滴に分裂するポイントに電気充電リングが配置され、蛍光強度が測定される直前にリングに電荷が与えられます。反対の電荷が液滴に捕捉され、液滴が流れから分離すると、液滴は電荷を帯びます。次に、帯電した液滴は静電偏向システムを通過し、電荷に基づいて液滴を容器に方向転換します。一部のシステムでは、電荷が流れに直接適用され、分離した液滴は流れと同じ符号の電荷を保持します。液滴が分離すると、流れは中性に戻ります。収集後、これらの細胞はさらに培養、操作、および研究することができます。^[要出典]

フローサイトメトリーは、細胞や粒子から散乱した光の特性を利用して、物理的特性を識別または定量的に測定します。ラベル、染料、染色剤は、マルチパラメータ分析（細胞に関するより多くの特性を理解する）に使用できます。免疫表現型解析は、標識抗体^[36]と染料や染色剤などの他の蛍光体を含む試薬 を使用して、異種細胞集団を分析することです。

フローサイトメトリーでは、さまざまな蛍光体がラベルとして使用できます。^[20]蛍光体、または単に「蛍光体」^[要出典]は、通常、細胞上または細胞内の標的特徴を認識する抗体に結合します。また、細胞膜または他の細胞構造に親和性を持つ化学物質に結合させることもできます。各蛍光体には特徴的なピーク励起および発光波長があり、発光スペクトルは重なり合うことがよくあります。したがって、使用できるラベルの組み合わせは、蛍光色素を励起するために使用されるランプまたはレーザーの波長と、使用可能な検出器によって異なります。^{[37]フローサイトメトリーは、定量的なツールとして蛍光を使用します。フローサイトメトリーの最高の感度は、}共焦点顕微鏡などの他の蛍光検出プラットフォームとは比較になりません。共焦点顕微鏡では、焦点外の信号が共焦点光学系によって除去され、細胞全体のあらゆる位置での個々の測定から連続的に画像が構築されるため、信号収集に利用できる時間が短縮されるため、絶対的な蛍光感度は一般的に低くなります。^[38]

量子ドットは、発光ピークが狭いため、従来の蛍光体の代わりに使用されることがあります。^[要出典]

マスサイトメトリーは、抗体に付着したランタニド同位体を利用することで蛍光標識の限界を克服する。この方法は理論的には40～60の識別可能な標識の使用が可能であり、30の標識で実証されている。 ^[39]マスサイトメトリーはフローサイトメトリーとは根本的に異なる。細胞をプラズマに導入してイオン化し、飛行時間型質量分析法で関連する同位体を定量化する。この方法では多数の標識を使用できるが、現時点ではフローサイトメトリーよりもスループットが低い。また、分析した細胞を破壊するため、選別による回収が不可能となる。^[39]

蛍光抗体を介して個々の細胞を標識および識別する機能に加えて、サイトカイン、タンパク質、およびその他の因子などの細胞産物も測定できます。ELISAサンドイッチアッセイと同様に、サイトメトリービーズアレイ（CBA）アッセイでは、通常、サイズとさまざまなレベルの蛍光強度で区別される複数のビーズ集団を使用して、1回のアッセイで複数の分析対象物を区別します。 捕捉された分析対象の量は、タンパク質の二次エピトープに対するビオチン化抗体を介して検出され、その後、ストレプトアビジン-R-フィコエリトリン処理が行われます。 ビーズ上のR-フィコエリトリンの蛍光強度は、488 nm励起源を備えたフローサイトメーターで定量化されます。 サンプル内の対象タンパク質の濃度は、蛍光シグナルを、既知濃度の分析対象の連続希釈から生成された標準曲線の蛍光シグナルと比較することによって取得できます。 一般に、サイトカインビーズアレイ（CBA）とも呼ばれます。

インピーダンスベースの単一細胞分析システムは、一般にコールターカウンターとして知られています。これは、事実上あらゆる種類の細胞と粒子を数え、サイズを測定するための確立された方法です。このラベルフリー技術は、最近、「ラボオンチップ」ベースのアプローチと、静的直流（DC）または低周波ACフィールドの代わりに無線周波数範囲（100kHz〜30MHz）の高周波交流（AC）を適用することによって強化されました。 ^{[40] [41]この特許取得済みの技術により、非常に正確な細胞分析が可能になり、膜}容量や生存率などの追加情報が得られます。比較的小型で堅牢であるため、現場でバッテリー駆動で使用できます。

細胞分析とフローサイトメトリーにおける測定可能な要素には、細胞の生物学と機能に関する重要な洞察を提供するさまざまな特性と指標が含まれます。フローサイトメトリー技術はこれらの要素を定量化して評価できるため、研究者は細胞のさまざまな側面を調査および分析できます。頻繁に調査される重要な定量化可能なパラメータは次のとおりです。

• アポトーシス: アポトーシスは、DNA 破壊、ミトコンドリア膜電位、透過性の変化、およびカスパーゼ活性を測定するフローサイトメトリーによって定量化できます。これらの測定により、計画された細胞死に関する重要な詳細が明らかになります。
• 細胞接着: フローサイトメトリーは、病原体と宿主細胞の接着などの細胞接着を調査するために使用できます。研究者は、特定のマーカーまたは蛍光タグを利用して、細胞接着イベントを定量化し、分析できます。
• 細胞色素: クロロフィルとフィコエリトリンは特定の細胞に存在する色素です。これらの色素の存在と量はフローサイトメトリーで測定でき、細胞の代謝と生理状態に関する情報が得られます。
• 細胞表面抗原: フローサイトメトリーは、分化クラスター (CD) マーカーとも呼ばれる細胞表面抗原を識別および定量化するためによく使用されます。研究者は、特定の抗体で細胞を標識することにより、表面抗原の発現に基づいて細胞集団を分類できます。

• 細胞生存率：フローサイトメトリーは、生細胞と死細胞を区別する蛍光色素またはマーカーを利用することで、細胞生存率アッセイとして使用できます。このパラメーターは、細胞の健康状態と実験または治療設定への反応を判断する上で重要です。フローサイトメトリーにおける細胞の生存率は約95％である必要がありますが、90％未満ではありません。^[42]
• 循環腫瘍細胞: フローサイトメトリーは、血液サンプルから循環腫瘍細胞 (CTC) を分離して精製するために不可欠です。特定のマーカーまたは特徴をターゲットにして CTC を発見および検査することができ、がんの診断、予後、および治療のモニタリングに役立ちます。
• 多剤耐性 (MDR) の特性評価: フローサイトメトリーは、薬剤耐性メカニズムに関連する蛍光色素または特定のマーカーの流出を評価することで、がん細胞の多剤耐性 (MDR) の特性評価に使用できます。この知識は、がん治療における薬剤耐性の理解と対処に役立ちます。
• 染色体の分析と分類: フローサイトメトリーは染色体の分析と分類に役立ち、ライブラリの作成や特定の染色体または染色体異常の識別を可能にします。
• DNA コピー数変異: DNA コピー数変異は、Flow-FISH や BACs-on-Beads テクノロジーなどのフローサイトメトリー技術を使用して測定できます。これらの技術は、がんなどの疾患に関連する遺伝子の変化を明らかにします。
• タンパク質の発現と修飾: 蛍光標識抗体またはプローブを使用することで、フローサイトメトリーによりタンパク質の発現レベルとリン酸化などの変化を評価することができます。このパラメーターは、タンパク質の機能とシグナル伝達ネットワークをより深く理解するのに役立ちます。
• 膜流動性: フローサイトメトリーは、膜特性に敏感な蛍光プローブを利用して膜流動性を検出できます。このパラメーターは、細胞膜のダイナミクスと機能に関する情報を提供します。
• 総 DNA および RNA 含有量: フローサイトメトリーでは、細胞内の総 DNA および RNA 含有量を測定できます。このデータは、細胞周期の分析、増殖の調査、遺伝子発現の変化の判定に役立ちます。
• 細胞内パラメータのモニタリング: フローサイトメトリーにより、pH、細胞内イオン化カルシウムおよびマグネシウム濃度、膜電位、グルタチオン濃度、酸化バーストなどの細胞内因子を測定できます。これらのデータは、細胞代謝、シグナル伝達、酸化ストレスに関する情報を提供します。
• 光散乱: 前方散乱 (FSC) と側方散乱 (SSC) の測定は、フローサイトメトリーでそれぞれ細胞体積と形態の複雑さを評価するために使用されます。これらの測定基準は、細胞のサイズ、粒度、および形状を表します。
• トランスジェニック製品: フローサイトメトリーは、生体内でのトランスジェニック製品、特に緑色蛍光タンパク質 (GFP) などの蛍光タンパク質や類似の変異体を評価するのに役立ちます。これにより、科学者は遺伝子発現、タンパク質の局在、および細胞動態を調査できます。
• さまざまな組み合わせ：フローサイトメトリーでは、DNAや表面抗原などの多くの測定可能なデータを統合して、生物学的特徴や機能に関する包括的な理解を得ることができます。^[43]

この技術は、分子生物学、病理学、免疫学、ウイルス学、^[44] 植物生物学、海洋生物学など、多くの分野で応用されています。^[45]特に移植、血液学、腫瘍免疫学および化学療法、出生前診断、遺伝学、性別選択のための精子選別の分野で、医療において幅広く応用されています。 フローサイトメトリーは、男性不妊検査において、DNA断片化に関連する精子細胞の異常を検出するために広く適用されています。 ^[46]また、DNA損傷、 [ ^{47 ]}カスパーゼ切断およびアポトーシスの検出の研究でも広く使用されています。^[48]光音響フローサイトメトリーは、多剤耐性菌（最も一般的にはMRSA）の研究で、染色したバクテリオファージでマークされた血液中の細菌を検出、区別、定量化するために使用されます。^[50]神経科学では、細胞表面抗原と細胞内抗原の共発現も分析できます。^[52]微生物学では、GFPをコードするトランスポゾン（TnMHA）で構築されたトランスポゾン変異体ライブラリーのスクリーニングと分類に使用できる。 ^[53]また生存率を評価するためにも使用できる。^{[54]タンパク質工学では、フローサイトメトリーは}酵母ディスプレイや細菌ディスプレイと組み合わせて使用​​され、望ましい特性を持つ細胞表面ディスプレイタンパク質変異体を同定する。組織学やIHCに対するフローサイトメトリーの主な利点は、抗原の量を正確に測定できることと、各細胞を複数の抗体蛍光体で染色できることである。現在の研究室では、各細胞に約10個の抗体を結合させることができる。これは、現在最大40個を測定できるマスサイトメーターよりもはるかに少ないが、価格が高く、測定速度も遅い。

水生システムでは、フローサイトメトリーは自己蛍光細胞または添加された染料で蛍光標識された細胞の分析に使用されます。この研究は、1981年にクラリス・イエンチがフローサイトメトリーを使用して赤潮を生成する渦鞭毛藻の蛍光を測定したことから始まりました。^[55]翌年、研究者らは、蛍光特性に基づいて区別できる複数の藻類種のフローサイトメトリー測定を発表しました。^[56] 1983年までに、海洋研究者は独自のフローサイトメーターを組み立てたり^[57]、市販のフローサイトメーターをバミューダ沖で採取した海水サンプルに使用したりして、植物プランクトン細胞を非生物物質と区別できること、およびシアノバクテリアを混合コミュニティから選別してその後研究室で培養できることを実証しました。^{[58]フローサイトメトリーにより、海洋研究者は薄暗い蛍光を発する}プロクロロコッカスと従属栄養微生物を区別することもできました。これは顕微鏡ベースの評価では難しい区別です。^[59]技術の進歩により、水生科学者は研究航海中にフローサイトメーターを継続的に使用できるようになり^[60]、フローサイトメーターは個々の植物プランクトン細胞の画像を提供するのに使用されています。^{[61] [62]}海洋科学者は、フローサイトメーターの選別能力を利用して、細胞の活動と多様性を個別に測定し、^{[63] [64]}近接して生息する微生物間の共生関係を調査し、^[65]海洋における複数のプロセスの生物地球化学的速度を測定しています。^[66]

細胞増殖は免疫システムの主要な機能です。結論を出すためには、細胞の増殖性を分析することがしばしば必要です。細胞増殖を判定するそのようなアッセイの 1 つに、追跡染料カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル (CFSE) があります。これは増殖細胞のモニタリングに役立ちます。このアッセイは、時系列実験中に定量的データと定性的データを提供します。^[67]この染料は、細胞内に存在する長寿命分子と共有結合します。細胞が分裂すると、分子も分裂し、娘細胞は親細胞よりも半分の染料を持ちます。この強度の減少は、フローサイトメトリーによって視覚化できます。^[68]文献では、フローサイトメトリーと CFSE のこの強力な技術は、白血病などの癌における標的細胞を殺す T 細胞の効率を見つけるために使用されています。急速な細胞死と緩慢な細胞死の両方を視覚化するために、科学者は特定の種類の細胞に対する抗体染色と蛍光標識マイクロビーズを用いたCFSE標識法を採用した。これにより、特定のサイトカイン処理による標的細胞の増殖に関する情報も得られた。^[69]

フローサイトメトリーは、ゲノムサイズ、より正確には細胞または核内のDNAの量を測定するために使用されています。ゲノムはゲノムシーケンシングによってより正確に分析できますが、シーケンシングで見逃される可能性のある（または染色体に割り当てることができない場合は分析ステップで除外される）微小染色体または反復配列の割合が高いため、これはしばしば困難です。ただし、フローサイトメトリーも完璧ではありません。結果として得られるゲノムサイズは、使用する染料に基づいて異なる場合があります。魚のゲノムを分析したところ、ヨウ化プロピジウム(PI) とDAPI をそれぞれ使用した場合、ゲノムサイズが大幅に異なりました。たとえば、Anguilla japonicaのゲノムには、PI で 1.09 pg の DNA が含まれるのに対し、DAPI では 1.25 pg でした。同様に、 Myxocyprinus asiaticusのゲノムには、2.75 pgのDNA（PI）と3.08 pg（DAPI）が含まれていることがわかりました。つまり、その差は12～14％程度でした。^[70]

• 組織サイトメトリーは、フローサイトメトリーの概念を組織切片にその場で適用し、空間的コンテキストを維持することでマーカーの定量化を実行するのに役立つ技術です。
• アポトーシスを起こしている細胞を検査するアネキシンA5親和性アッセイでは、フローサイトメトリーがよく使用される。
• 細胞周期分析
• コールターカウンター
• サイトメトリー
• 誘電泳動
• ユーロフロー
• フローサイトメトリー標準
• マスサイトメトリー
• 顕微蛍光測定
• 生存率アッセイ

• ウィキメディア・コモンズのフローサイトメトリーに関連するメディア
• 米国国立医学図書館医学件名標目表(MeSH)のフローサイトメトリー