細胞周期解析

DNA含有量測定による細胞周期解析は、細胞周期の異なる段階にある細胞を識別するためにフローサイトメトリーを最も頻繁に用いる方法です。解析に先立ち、細胞は通常、透過処理され、ヨウ化プロピジウム（PI）や4,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）などのDNAを定量的に染色する蛍光色素で処理されます。染色された細胞の蛍光強度は、細胞に含まれるDNA量と相関します。S期中にDNA含有量が倍増するため、 G0_期およびG1期（ _S期前）、S期、G2期およびM期（S期後）の細胞のDNA含有量（および蛍光強度）によって、細胞周期_の主要段階（ G0 /G1期、S期、G2/M期）における細胞周期の段階位置が特定されます_。個々_の細胞_の細胞DNA含有量は、細胞周期の主要段階における細胞の相対頻度（割合）に関する情報を提供するために、しばしば頻度ヒストグラムとしてプロットされます。

DNA含有量頻度ヒストグラムで明らかになる細胞周期異常は、細胞周期の進行を特定のチェックポイントで中断させるようなDNA損傷など、さまざまな種類の細胞損傷後によく観察されます。このような細胞周期進行の停止は、正常な細胞が癌細胞に変化するのを防ぐ効果的なDNA修復（発癌）につながるか、多くの場合アポトーシスによる細胞死につながる可能性があります。G ₀またはG ₁での細胞の停止は、たとえば血清欠乏後の栄養素（成長因子）の不足の結果としてよく見られます。細胞周期分析は、1969年にロスアラモス科学研究所でカリフォルニア大学のグループがフェルゲン染色法を使用して初めて記述しました。^{[ 1 ]}プロピジウムヨウジド染色を使用した細胞周期分析の最初のプロトコルは、1975年にハーバード大学医学部のAwtar Krishanによって発表され、今日でも広く引用されています。^{[ 2 ]}

細胞周期の多項目解析には、細胞DNA含有量の測定に加えて、細胞周期に関連するその他の構成要素/特徴が含まれます。細胞DNAとRNA含有量の同時測定、またはメタクロマティック色素アクリジンオレンジを使用した低pHでのDNA変性感受性により、G _1Q、G _1A、およびG _{1B細胞周期コンパートメントが明らかになり、S、G 2} 、および分裂細胞を区別することも可能になります。^{[ 3 ]} _{G 1Q}の細胞は静止しており、一時的に細胞周期から離脱しています（G ₀としても識別できます）。G _1Aは成長期にあり、G _1BはSに入る直前の細胞であり、その成長（RNAとタンパク質含有量、サイズ）はDNA複製を開始する細胞と同様です。同様の細胞周期コンパートメントは、DNA 含有量との関連でサイクリン D1、サイクリン E、サイクリン A、サイクリン B1の発現を測定する多パラメータ分析によっても認識されます^{[ 4 ]。}フローサイトメトリーによる DNA 含有量と DNA 前駆体5-ブロモ-2'-デオキシウリジン(BrdU)の取り込みの同時測定は、特に有用なアッセイであり、in vitro および in vivo での細胞周期の分析に広く使用されています。^{[ 5 ]}しかし、 BrdU よりも検出にいくつかの利点がある前駆体である5-エチニル-2'-デオキシウリジン(EdU) の取り込みが、現在では DNA 複製 (S 期) 細胞を検出するための好ましい方法となっています。^{[ 6 ]}

Hoechst 33342で染色を行わない限り、細胞周期分析のために細胞を準備する最初のステップは、細胞の形質膜の透過性を高めることです。これは通常、Triton X-100やNP-40などの弱界面活性剤^{[ 7 ]}を含む緩衝液中で細胞をインキュベートするか、エタノールで固定することによって行われます。ほとんどの蛍光 DNA 色素 (例外の 1 つはHoechst 33342 ) は形質膜透過性ではなく、つまり、無傷の細胞膜を通過できません。したがって、透過性を高めることは、次のステップである細胞の染色を成功させるために非常に重要です。

染色ステップの前（または染色ステップ中）に、 RNAを除去するために細胞をRNase Aで処理することがよくあります。これは、DNAを染色する特定の色素がRNAも染色し、結果を歪めるアーティファクトを生成するため重要です。例外はメタクロマティック蛍光色素アクリジンオレンジで、特定の染色プロトコルではRNA（赤色発光）とDNA（緑色蛍光）の両方を区別して染色できます。また、別のプロトコルでは、RNAを除去し、DNAを部分的に変性させた後、二本鎖DNA（緑色蛍光）と一本鎖DNA（赤色発光）を区別して染色できます^{[3] 。ヨウ化プロピジウムとアクリジンオレンジの他に、よく使用される定量可能な色素には、DRAQ5、7-}アミノアクチノマイシンD、DAPI、Hoechst 33342などがあります（ただし、これらに限定されません）。

• 「細胞周期の基礎」（PDF）。ユニバーシティ・カレッジ・ロンドン。2011年6月6日にオリジナル（PDF、0.1 MB）からアーカイブ済み。 2010年5月20日取得。
• Rabinovitch, Peter. 「細胞周期解析入門」（PDF、0.5 MB）。Phoenix Flow Systems, Inc. 2010年5月20日取得。