細胞選別

蛍光活性化細胞選別は、フローサイトメトリー細胞選別、または略称FACSとしても知られており、これはベクトン・ディッキンソン社の商標です。蛍光活性化細胞選別は、フローサイトメトリーを利用して、形態学的パラメータと複数の細胞外および細胞内タンパク質の発現に基づいて細胞を分離します。この方法は、マルチパラメータ細胞選別を可能にし、細胞を小さな液滴にカプセル化し、選択的に電荷を与え、外部電場によって選別します。蛍光活性化細胞選別は、目的のイベントの選別を成功させるために連携して動作するいくつかのシステムを備えています。これには、流体システム、光学システム、および静電システムが含まれます。流体システムは、液体の流れから小さな均一な液滴で正確なタイミングで分離を確立する必要があり、個々の細胞を含む液滴を静電的に偏向させることができます^{[ 2 ]。}リチャード・スウィートの発明^{[ 3 ]}に基づき、細胞選別装置の液体ジェットの液滴形成は、ノズルオリフィスの出口にある超音波トランスデューサの振動によって安定化されます。擾乱は指数関数的に増大し、正確なタイミングでジェットが液滴に分裂します。選別されるべき目的の細胞はセンシングゾーンで測定され、流れに沿って分裂点まで移動します。細胞を含む液滴が無傷の液体ジェットから分離される間、目的の細胞を含む液滴が2枚の偏向板間の電場内で偏向され、選別されるように、液体ジェットに電圧パルスが与えられます。その後、液滴は偏向板の下に配置された収集チューブまたは容器によって捕捉されます。^{[ 2 ]} フローサイトメトリーによる細胞選別は、1つまたは複数の表面マーカーに基づいて非常に高い特異性を示しますが、1つの制限は、作業日中に処理できる細胞の数によって構成されます。このため、特にターゲット細胞が比較的まれで、大量の細胞を処理する必要がある場合は、免疫磁気細胞選別による目的の集団の事前濃縮がよく検討されます。さらに、フローサイトメトリー細胞選別装置は複雑な装置であり、一般的にはフローサイトメトリー施設または設備の整った研究室で十分な訓練を受けたスタッフのみが使用し、また通常は大型であるため、生物学的安全キャビネット内に設置することが常に可能とは限りません。したがって、サンプルの無菌性を常に確保できるとは限らず、流体システムは洗浄可能ではあるものの使い捨てではないため、サンプル間で交差汚染が発生する可能性があります。考慮すべきもう 1 つの点は、装置内部での液滴生成により、感染性サンプルを使用する場合に操作者に危険なエアロゾルが形成される可能性があることです。これらの最後の考慮事項は、細胞ソーティングが臨床用途 (たとえば細胞療法) に使用される場合に特に重要であり、医薬品製造管理基準(GMP) の条件下で実施する必要があります。研究者は、さまざまな蛍光色素を使用してマルチカラーパネルを設計し、正確に定義された複数の細胞タイプを同時にソーティングすることに成功することができます。図 A は、ネガティブ細胞選択 (不要なグループ) の蛍光活性化細胞ソーティングを示し、図 B は、ポジティブ細胞選択 (目的のグループ) の FACS を示しています。

MACS

免疫磁気細胞選別は、免疫磁気細胞分離、免疫磁気細胞濃縮、または磁気活性化細胞選別とも呼ばれ、一般的にはMiltenyi GmbHの商標であるMACSという略称で知られています。免疫磁気細胞選別は、磁場を通過するビーズの分離に基づいています。さまざまな企業が、細胞集団の濃縮または除去のためのさまざまなソリューションを提供しています。免疫磁気細胞選別は、細胞表面タンパク質発現（抗原）に基づいて、異種混合細胞を濃縮する方法を提供します。この技術は、標的細胞集団上の抗原に特異的なモノクローナル抗体に、小型で不活性な超磁性粒子を結合させることに基づいています。これらの抗体ビーズ複合体に標識された細胞は、強磁性マトリックスを含むカラムを介して分離されます。マトリックスに磁場を印加すると、ビーズはカラム内のマトリックスに付着し、ビーズを持つ細胞は通過できなくなります。標識されていない細胞はマトリックスを通過でき、フロースルーで回収されます。カラムに捕捉された細胞を溶出するには、磁場を取り除くだけです。したがって、免疫磁気細胞選別法は、細胞の陽性濃縮または除去のためのさまざまな戦略を可能にします。^{[ 2 ]}免疫磁気ビーズは小さく、通常は下流のアッセイに干渉しませんが、一部のアプリケーションではそれらを取り除く必要がある場合があります。この分離方法を使用すると、細胞数を増やしても処理時間が大幅に増加せず、バイオセーフティキャビネット内で細胞選別を実行すればサンプルの無菌性が保証されます。一方、この技術では、単一のマーカーに基づいてのみ細胞を分離することができ、タンパク質発現の異なるレベル（定量分析）を区別することはできません。免疫磁気細胞選別法は、特にNPC（神経前駆細胞）培養で使用すると、管理が容易で生細胞への損傷が最小限であるため、有益であることが示されています。^{[ 5 ]}

NPC培養は、生きた脳細胞が敏感で互いに汚染し合う傾向があるため、特に扱いが難しい。^{[ 5 ]}より明確な結果を得るためには、研究室はより純度の高い材料、つまりより純粋なNPC株を必要とする。^{[ 5 ]} 2019年に行われた研究（ニューヨーク幹細胞財団と前頭側頭型認知症協会の資金援助を受けて）では、免疫磁気細胞選別法が、細胞株への損傷を最小限に抑えつつ、そのような純度を得るための安価で簡単な方法であることが判明し、より高品質の細胞を維持し、より均質なNPCを収集し、神経疾患の効果的な治療法を見つける可能性を高める。^{[ 5 ]}彼らは、免疫磁気法と蛍光活性化法の両方を使用して、 CD271-（間葉系幹細胞の有用なマーカー）とCD133 +（がん幹細胞のマーカー）をフィルタリングし、各方法の有効性を比較した。^{[ 5 ]}

免疫磁気細胞選別法は、生殖補助（人工授精）や網膜移植治療にも用いられています。^{[ 6 ] [ 7 ]}生殖補助の場合、アポトーシスを起こした精子細胞（死滅または損傷した細胞）を分離することで、アポトーシスを起こしていない精子細胞（断片化していない細胞）をより多く採取し、受精の可能性を高めることができます。^{[ 6 ]}この種の治療は、繰り返し行うことで、授精時に存在するアポトーシスを起こしていない細胞の量を増やすことができるため、より効果的であることが示されています。^{[ 6 ]}

2018年にフランスで行われた研究（パリの視覚研究所やフランス網膜協会など複数の個人や機関の支援を受けて）では、ラットと免疫磁気細胞選別法を用いて、光受容体（網膜で光に反応する細胞）を移植することで失明を治せる可能性があることが示されました。^{[ 7 ]}このプロセスでは、マイクロビーズをCD73酵素に結合させて、網膜オルガノイドからPR（光受容体）を分離するのに役立てました。^{[ 7 ]} CD73+抗原がRCVRN +細胞（眼のカルシウム結合タンパク質）とともに発現すると、このCD73+とRCVRN+の組み合わせが分裂後PR前駆細胞とともに修復に使用できることが研究者に示されました。^{[ 7 ]}この研究ではヒトでの成功を検証することはできませんでしたが、損傷を受けていない光受容体とCD73抗原のペアリングとラットへの移植の成功に基づいて、さらなる研究の基礎を築きました。^{[ 7 ]}細胞分離と移植によるペアリングの成功は、完全な失明を含む網膜疾患の潜在的な治療法への期待を示している。これまでのところ、部分的な視力回復のみが報告されている。^{[ 7 ]}

蛍光活性化細胞選別装置や免疫磁気細胞選別装置には様々な限界があるため、マイクロ流体細胞選別装置が数多く開発されてきた。これらのうちいくつかは既に市販されているか、商業開発段階にある。マイクロ流体細胞選別装置の設計に関する研究では、ポリジメチルシロキサン（PDMS）などの材料を用いたソフトリソグラフィー技術がよく用いられる。

マイクロ流体ソーターの主な利点は、密閉された使い捨て滅菌カートリッジで蛍光活性化細胞ソーティングを実行できる可能性があることです。このような密閉カートリッジは、FACSシステムから放出される液滴を介してオペレーターがバイオハザードに曝されるのを防ぎます。その他の利点としては、細胞への流体力学的ストレスが軽減されるため、細胞生存率への影響が軽減されることが挙げられます。発表されているデバイスの中には、マルチウェイソーティングの可能性、低コストの製造方法によるカートリッジのコスト削減、低消費電力、小型化が可能なものがあり、一部のデバイスはクレジットカードほどの大きさです。高純度の出力と最大で約50,000細胞/秒の速度を達成しているものもあります。^{[ 8 ] [ 9 ] [ 10 ] [ 11 ]}

マイクロ流体細胞選別装置は、能動型と受動型の2種類に分類できます。能動型装置は、リアルタイムで行われる細胞計測に基づいて個々の細胞を選別します。受動型装置は、細胞が流体の流れや表面とどのように相互作用するかという、細胞間の物理的な違いを利用します。

蛍光ベースおよび免疫磁気細胞選別が普及する以前は、抗体を用いた細胞分離および濃縮のいくつかの方法が用いられていた。^{[ 43 ]}これらには、抗体および補体介在細胞分離、ポリスチレン免疫親和性デバイス、および多孔質カラムに固定化された抗体を使用するCellPro CEPRATE® SCシステムが含まれる。後者は、造血幹細胞の分離のためのFDA承認を受けた最初の医療機器であった。

抗体を用いた新しい細胞分離技術である浮力活性化細胞選別法（BACS）は、抗体が細胞表面に結合することでマイクロバブルが細胞に結合する分離技術である。標的細胞は浮遊によって生物学的サンプルから除去される。^{[ 44 ]}