組織細胞計測

組織画像サイトメトリーまたは組織サイトメトリー^{[1]は、デジタル組織}病理学の一手法であり、従来のデジタル病理学 (ガラススライドのスキャンと仮想スライドの生成) と計算病理学(デジタル分析) を 1 つの統合アプローチに組み合わせ、あらゆる種類の疾患、組織、細胞タイプ、および分子マーカーとこれらのマーカーを視覚化する対応する染色方法に対応するソリューションを提供します。組織サイトメトリーでは、複数の市販のスライド スキャナーで生成できる仮想スライドと、機械学習およびディープラーニングアルゴリズムを優先的に含む専用の画像分析ソフトウェアを使用します。^{[2] [3] [4]}組織サイトメトリーでは、厚い組織内の細胞分析が可能になり、定義された細胞サブポピュレーションの空間情報を含む形態学的およびコンテキスト情報を保持できます。^{[1] [5]}

このプロセスでは、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）または凍結組織切片（「クライオカット」とも呼ばれる）のいずれかの組織サンプルが、免疫組織化学^[6]（IHC）または免疫蛍光マーカーでラベル付けされ、ハイスループットスライドスキャナーでスキャンされ、仮想スライドから収集されたデータは、組織のコンテキストで個々の細胞を自動的に識別し、各細胞の核と細胞質を区別できるソフトウェアを使用して処理および分析されます。 ^{[2] [4]}追加のアルゴリズムにより、細胞膜、細胞内構造（細胞骨格繊維、液胞、核小体など）および/または多細胞組織構造（腺、糸球体、表皮、または腫瘍病巣）を識別できます。^[7]蛍光活性化細胞選別（FACS）は、単一細胞の蛍光シグナルを測定する分析方法であり、シグナルは抗体媒介染色技術とフローサイトメトリーによって検出された表現型に由来します。^[8]フローサイトメトリーの主な制限は、その名前が示すように、溶液中の細胞にしか適用できないことです。固形組織を「可溶化」する方法は存在しますが、そのような処理は組織の構造と空間的コンテキストを永久に破壊します。したがって、組織サイトメトリーは、固形組織切片（および接着細胞培養）のin situでのFACSのような分析を提供することで、基礎研究、臨床診療、臨床試験におけるフローサイトメトリーと蛍光顕微鏡の使用を補完します^[9]。フローサイトメトリーに対する組織サイトメトリーの利点は、組織サイトメトリーでは細胞を液体に懸濁する必要がないため、組織の構造、形態、およびコンテキスト情報の完全性を維持するのに役立ち、フローサイトメトリーでは不可能な正確で正確なコンテキスト分析をさらに支援することです。

免疫組織化学は臨床診療で使用されており、がんの可能性があるすべての患者から組織生検を収集し、ホルマリンで固定してパラフィンに包埋します。これらの組織切片はミクロトームで連続的に切断され、臨床診断のための診断材料となる薄切片を提供します。^[6]最初にヘマトキシリンおよびエオシン染色で染色してがん細胞を検出します。増殖、系統、予後、および発がん性のターゲットに対して複数のマーカー染色が行われます。病理学者は光学顕微鏡を使用して対物レンズを介した評価を行い、染色をパーセンテージまたは陽性/陰性で採点して診断を確定します。視覚的な評価により、主観的な診断と治療計画が提供されます。デジタル病理学の出現は、病理学の分野に大きな飛躍をもたらしました。ガラススライドをデジタル画像に変換することで、病理学者が組織標本を操作する方法に革命をもたらしました。ただし、デジタル病理学の初期段階では、主に画像の表示と共有に重点が置かれていました。これにより遠隔診察が可能になり、画像のアーカイブ化が容易になりましたが、病理学の中核プロセス、つまり人間の専門家による組織形態の手動解釈は根本的に変わりませんでした。

固定組織内の免疫染色細​​胞に対してフローサイトメトリーのような分析を実行するために、より堅牢で自動化されたシステムが設計され、組織サイトメトリーと呼ばれています。^{[10] [11]}この技術は、SteinerとEcker（TissueGnosticsのCEO/創設者）による特許に基づいて1990年代に導入され、^[12]「蛍光染料や色素原を介して視覚化された組織切片または細胞培養内の多様な細胞集団の細胞計測分析」の手順を説明しました。組織サイトメトリーは、デジタル病理学の革新的な拡張として登場し、画像ベースの分析と定量的でデータ主導の洞察との間のギャップを埋めることを約束しました。この技術は、高度なイメージング技術、計算能力、人工知能（AI）を活用して、組織スライドから意味のある情報を抽出します。その前身とは異なり、組織サイトメトリーは単なる画像の視覚化を超え、組織標本の複雑な空間的および分子的景観を詳しく調べます。本質的に、組織サイトメトリーは、細胞と組織の特徴の自動的かつ定量的な分析を可能にします。洗練されたアルゴリズムと機械学習モデルを採用することで、核を正確にセグメント化し、細胞タイプを識別し、組織のコンテキスト内でタンパク質発現レベルを定量化できます。このレベルの粒度と精度は、従来の顕微鏡検査では達成できませんでした。

21世紀初頭には、ヘルナニらが免疫染色組織で仮想フローサイトメトリーを行うための特許を申請した。^[13]このフローサイトメトリーの基礎は、1982年にジレットらが発表した手順に由来しており、因子分析とスペクトル参照ライブラリを組み合わせてスペクトル混合物の定性分析を行う方法が記載されている。^{[14]この研究に続いて、周Rらは、}ジアミノベンジジン（DAB）を基質としてペルオキシダーゼ-抗ペルオキシダーゼ（PAP）複合体法を用いて前立腺腫瘍の組織切片中の前立腺特異酸性ホスファターゼ（PSAP）を定量する方法を発表した。^[15]

AI と機械学習の統合は、組織細胞測定法の開発に大きく貢献しています。これらの技術により、システムは膨大な量の注釈付き組織画像データセットから学習できるようになり、パターンを認識して正確な予測を行うことができます。たとえば、AI 駆動型アルゴリズムをトレーニングして、特定の細胞タイプを識別したり、病気に関連する微妙な形態変化を検出したり、腫瘍微小環境内の免疫細胞の密度を定量化したりすることができます。

さらに、AI を活用した核セグメンテーションは、組織細胞計測の重要な要素です。個々の核を正確に描写することで、研究者は核のサイズ、形状、質感に関する貴重な情報を抽出でき、さまざまな病理学的状態と相関させることができます。同様に、組織セグメンテーション アルゴリズムにより、腫瘍、間質、免疫浸潤などのさまざまな組織コンパートメントを識別できるため、細胞成分間の空間関係の分析が容易になります。

組織サイトメトリーが病理学に与える影響は計り知れません。定量的かつ再現性のあるデータを提供することで、この技術は診断および予後プロセスを効率化できる可能性があります。たとえば、組織サイトメトリーは病理学者が手動検査で見逃される可能性のある微妙なバイオマーカーを特定できるように支援し、より早期かつ正確な診断につながります。さらに、腫瘍量と免疫浸潤を定量化することで、組織サイトメトリーは患者の転帰を予測し、治療決定に役立てることができます。

組織サイトメトリーは診断の域を超えて、新薬開発と臨床研究の新たな道を切り開きます。腫瘍細胞と免疫微小環境の正確な表現型解析を可能にすることで、潜在的な治療標的の特定と薬剤の有効性の評価を容易にすることができます。さらに、組織サイトメトリーは疾患の進行と耐性のメカニズムの研究に使用でき、新しい治療戦略の開発への道を切り開きます。

最新の組織サイトメーターは、組織サンプル内および/または懸濁液中の何千もの細胞を「リアルタイム」で分析することができ、細胞選別装置として構成されている場合は、指定されたグレー値で粒子を積極的に区別することができます。

組織サイトメーターには、3 つの主なコンポーネントがあります。スライドガラス上の免疫組織化学および/または蛍光マーカーで標識された組織切片の高品質の仮想画像を取得するための高スループット スキャナー、赤緑青 (RGB) 形式の明視野または蛍光信号を検出する信号検出器、およびグレー値の信号を分析および解釈するための開発されたアルゴリズムを備えたコンピューターです。

腫瘍微小環境：組織サイトメトリーは、IHC/IF処理された組織切片内での免疫ランドスケープや腫瘍血管新生の特定など、腫瘍微小環境を特徴付ける研究で頻繁に使用されています。その理由の1つは、この技術を使用すると複雑な組織構造がそのまま維持されるため、細胞表現型や多細胞構造間の空間的関係も分析できるためです。^[16]

組織サイトメトリーを利用することで、複数の研究グループが、さまざまな免疫細胞サブポピュレーション（CD4、CD68、CD8、CD20、Foxp3、PD1）がさまざまな種類のがん（乳がん、大腸がん、胃がん、黒色腫、非小細胞肺がんなど）の患者の生存に与える影響を実証することができました。^[16]がん治療では、免疫チェックポイント（抗腫瘍免疫反応を阻害する分子）を標的とする新しい治療戦略があるため、組織サイトメトリーによって得られる洞察は、新しい標的分子/バイオマーカーの発見や、患者にとって最適な治療戦略の決定に役立つ可能性があります。^[16]

免疫学：免疫細胞のコンテキストは、適応免疫細胞や自然免疫細胞の機能障害に起因することが多い炎症性疾患の病因を解明する上で重要です。組織サイトメトリーは、特定の細胞、特に異種集団をその本来の組織環境内で検出して位置を特定し、疾患の背後にある手がかりを特定するのに役立ちます。^[17]  たとえば、IgG4関連疾患の調査に使用されました。ある論文では、線維性縦隔炎がTh2細胞ではなくCD4 + CTLによって引き起こされ、CD4 + CTLの浸潤が組織サイトメトリーによって示されたと報告されています。^[18]フォローアップ研究では、濾胞性T細胞がIgG4関連疾患とキムラ病におけるB細胞のクラススイッチイベントにどのように影響するかを調査しました。研究者は、組織サイトメトリーを使用して、AICDA + CD19 + B細胞とIgG4発現の間に相関関係があることを発見しました。^[19]

間葉系幹細胞の特性評価：間葉系幹細胞（MSC）は、骨、軟骨、筋肉、発達中の歯、脂肪組織など、再生医療にとって臨床的に重要ないくつかのサブタイプに分化できる多能性細胞です。^[20]しかし、最低限の表現型の基準は定義されているものの、MSCは不均一な性質のため、異なるバイオマーカーに関してさらに特性評価する必要があります。^[21]組織サイトメトリーは、静止期MCSのバイオマーカーを説明し、さらにこの集団に対するヒアルロン酸の効果を特性評価するのに役立ちます。 ^[22]組織サイトメトリーは、MSCと神経膠芽腫との相互作用を調査するためにも使用できます。細胞融合、細胞外小胞の移動、細胞間コミュニケーションを特性評価します。^[23]さらに、組織サイトメトリーは、アルツハイマー病のモデルとしてMSCを移植したマウスの海馬を画像化し、M1/M2ミクログリアを視覚化するために使用されています。^[24]

COVID-19： COVID-19パンデミックでは、病気の進行と重症度を概説するためにさまざまなツールが必要でした。研究者らは組織サイトメトリーを使用して、免疫細胞とSARS-CoV-2ウイルスの相互作用とそれが病気に与える影響について報告しました。たとえば、ある研究では、重症COVID-19の肺でCD4+細胞傷害性T細胞が大幅に増加したことが示されました。^[25]別の発見は、急性COVID-19におけるリンパ節と脾臓の胚中心の喪失を示しており、これは多色免疫蛍光サイトメトリーによって示されました。^[26]

神経科学：神経発達過程の追跡は、神経科学の活発な研究分野です。定量的組織分析は、神経系におけるさまざまな刺激の役割を決定するためにこの分野で広く使用されています。^{[27] [28] [29] [30]}ある研究グループは、多能性幹細胞の神経分化に対する磁場の影響について報告し、組織サイトメトリーを使用して表現型の影響を観察しました。^[27]神経科学における組織サイトメトリーの別の応用は、ストレスが視床下部ニューロンに与える影響を評価するために設計された研究で示されました。^[28]