円偏光二色性

電磁放射は電気的な${\displaystyle {\boldsymbol {E}}}$磁気${\displaystyle {\boldsymbol {B}}}$互いに垂直で伝搬方向にも垂直に振動する電場、すなわち横波。^{[ 7 ]}直線偏光は電場ベクトルが1つの平面内でのみ振動する場合に発生するが、円偏光は電場ベクトルの方向が伝搬方向を中心に回転し、ベクトルの大きさが一定のままの場合に発生する。空間内の1点において、円偏光ベクトルは波の周波数の1周期にわたって円を描くため、この名前が付けられている。下の2つの図は、ある瞬間の直線偏光と円偏光の電場ベクトルを、さまざまな位置について示している。円偏光の電場ベクトルのプロットは、伝搬方向に沿ってらせんを形成する。${\displaystyle {\boldsymbol {k}}}$左円偏光（LCP）が観測者に向かって伝搬する場合、電場ベクトルは反時計回りに回転します。^{[ 2 ]}右円偏光（RCP）の場合、電場ベクトルは時計回りに回転します。

円偏光が吸収性の光学活性媒体を通過するとき、右偏光と左偏光の速度は異なる（${\displaystyle c_{\mathrm {L} }\neq c_{\mathrm {R} }}$）波長（${\displaystyle \lambda _{\mathrm {L} }\neq \lambda _{\mathrm {R} }}$）そしてそれらが吸収される程度（${\displaystyle \varepsilon _{\mathrm {L} }\neq \varepsilon _{\mathrm {R} }}$)円偏光二色性とは、${\displaystyle \Delta \varepsilon \equiv \varepsilon _{\mathrm {L} }-\varepsilon _{\mathrm {R} }}$[ ^{5 ]}光線の電場は分子と相互作用する際に電荷の直線的な変位（電気双極子）を引き起こし、一方^、磁場は電荷の循環（磁気双極子）を引き起こします。これら2つの運動が組み合わさることで、電子はらせん運動で励起され、これには並進運動と回転運動、およびそれらに関連する演算子が含まれます。回転強度と実験的に決定された関係${\displaystyle R}$サンプルと${\displaystyle \Delta \varepsilon }$は

${\displaystyle R_{\mathrm {exp} }={\frac {3hc10^{3}\ln(10)}{32\pi ^{3}N_{\mathrm {A} }}}\int {\frac {\Delta \varepsilon }{\nu }}\mathrm {d} {\nu }}$

回転強度も理論的に決定されており、

${\displaystyle R_{\mathrm {theo} }={\frac {1}{2mc}}\mathrm {Im} \int \Psi _{g}{\widehat {M}}_{\mathrm {(elec.dipole)} }\Psi _{e}\mathrm {d} \tau \bullet \int \Psi _{g}{\widehat {M}}_{\mathrm {(mag.dipole)} }\Psi _{e}\mathrm {d} \tau }$

これら２つの式から、ゼロでないためには${\displaystyle \Delta \varepsilon }$電気双極子モーメント演算子と磁気双極子モーメント演算子（${\displaystyle {\widehat {M}}_{\mathrm {(elec.dipole)} }}$そして${\displaystyle {\widehat {M}}_{\mathrm {(mag.dipole)} }}$) は同じ既約表現として変換されなければならない。${\displaystyle \mathrm {C} _{n}}$そして${\displaystyle \mathrm {D} _{n}}$これらが起こり得る唯一の点群であるため、キラル分子のみがCD活性を示す。

簡単に言うと、円偏光自体が「キラル」であるため、キラル分子との相互作用が異なります。つまり、2種類の円偏光は吸収される度合いが異なります。CD実験では、選択した波長の左円偏光と右円偏光を等量ずつ交互に（キラル）試料に照射します。2つの偏光のうち一方が他方よりも多く吸収され、この波長依存的な吸収差を測定することで、試料のCDスペクトルが得られます。分子との相互作用により、光の電場ベクトルは試料を通過した後に楕円軌道を描きます。

分子のキラリティが構造的なものではなく、立体配座的なものであることが重要である。つまり、例えば、らせん状の二次構造を持つタンパク質分子は、立体配座の変化に伴って円偏光二色性（CD）スペクトルが変化する可能性がある。

モル楕円率

それでも${\displaystyle \Delta A}$通常は測定されますが、歴史的な理由から、ほとんどの測定値は楕円率の度数で報告されます。モル楕円率は、濃度で補正された円二色性です。モル円二色性とモル楕円率、${\displaystyle [\theta ]}$は、次の式によって容易に相互変換されます。

${\displaystyle [\theta ]=3298.2\,\Delta \varepsilon .\,}$

この関係は、偏光の楕円率を次のように定義することによって導き出される。

${\displaystyle \tan \theta ={\frac {E_{\mathrm {R} }-E_{\mathrm {L} }}{E_{\mathrm {R} }+E_{\mathrm {L} }}}\,}$

どこ

${\displaystyle E_{\mathrm {R} }}$そして${\displaystyle E_{\mathrm {L} }}$は、それぞれ右円偏光と左円偏光の電場ベクトルの大きさである。

いつ${\displaystyle E_{\mathrm {R} }}$等しい${\displaystyle E_{\mathrm {L} }}$（右円偏光と左円偏光の吸光度に差がない場合）${\displaystyle \theta }$は 0° で、光は直線偏光です。${\displaystyle E_{\mathrm {R} }}$または${\displaystyle E_{\mathrm {L} }}$（円偏光が一方向で完全に吸収される場合）はゼロに等しい。${\displaystyle \theta }$角度は45°で、光は円偏光している。

一般的に、円偏光二色性効果は小さいため、${\displaystyle \tan \theta }$は小さく、次のように近似できます。${\displaystyle \theta }$ラジアンで。強度または放射照度なので、${\displaystyle I}$光の散乱は電場ベクトルの二乗に比例するため、楕円率は次のようになる。

${\displaystyle \theta ({\text{radians}})={\frac {(I_{\mathrm {R} }^{1/2}-I_{\mathrm {L} }^{1/2})}{(I_{\mathrm {R} }^{1/2}+I_{\mathrm {L} }^{1/2})}}\,}$

次に、I を自然対数形式のベールの法則で代入します。

${\displaystyle I=I_{0}\mathrm {e} ^{-A\ln 10}\,}$

楕円率は次のように表すことができます。

${\displaystyle \theta ({\text{radians}})={\frac {(\mathrm {e} ^{{\frac {-A_{\mathrm {R} }}{2}}\ln 10}-\mathrm {e} ^{{\frac {-A_{\mathrm {L} }}{2}}\ln 10})}{(\mathrm {e} ^{{\frac {-A_{\mathrm {R} }}{2}}\ln 10}+\mathrm {e} ^{{\frac {-A_{\mathrm {L} }}{2}}\ln 10})}}={\frac {\mathrm {e} ^{\Delta A{\frac {\ln 10}{2}}}-1}{\mathrm {e} ^{\Delta A{\frac {\ln 10}{2}}}+1}}\,}$

以来${\displaystyle \Delta A\ll 1}$この式は、指数関数をテイラー級数で一次まで展開し、その後、次の項を破棄することで近似できます。${\displaystyle \Delta A}$1と比較し、ラジアンから度数に変換する場合：

${\displaystyle \theta ({\text{degrees}})=\Delta A\left({\frac {\ln 10}{4}}\right)\left({\frac {180}{\pi }}\right)\,}$

溶質濃度と経路長の線形依存性は、モル楕円率を次のように定義することによって除去される。

${\displaystyle [\theta ]={\frac {100\theta }{Cl}}\,}$

そして、最後の2つの式をベールの法則と組み合わせると、モル楕円率は次のようになる。

${\displaystyle [\theta ]=100\,\Delta \varepsilon \left({\frac {\ln 10}{4}}\right)\left({\frac {180}{\pi }}\right)=3298.2\,\Delta \varepsilon \,}$

モル楕円率の単位は、歴史的に(deg·cm²/dmol)です^。モル楕円率を計算するには、試料濃度(g/L)、セル光路長(cm)、および分子量(g/mol)を知る必要があります。

試料がタンパク質の場合、分子量の代わりに平均残基重量（含まれるアミノ酸残基の平均分子量）が用いられることが多く、これは実質的にタンパク質をアミノ酸溶液として扱うことを意味します。平均残基楕円率を用いることで、分子量の異なるタンパク質の円偏光二色性（CD）スペクトルを比較することが容易になります。この正規化されたCDスペクトルは、タンパク質構造の研究において重要です。

円偏光二色性（CD）分光法における蛍光測定は、入射光に対して90度の角度で記録され、タンパク質の安定性や構造変化に関する追加的な知見を提供する補完的なデータチャネルとしてしばしば機能します。トリプトファンやチロシンなどの芳香族残基からの固有蛍光を検出することで、研究者は構造変化に伴う環境変化を評価できます。蛍光データは、特に温度上昇実験において、CD信号と同時に取得することができ、発光強度や波長シフトの変化を追跡することで、タンパク質の展開過程を監視するのに役立ちます。このプロセスは 、例えば、 1分あたり1℃の速度で温度を連続的に上昇させながら、1℃間隔でCDスペクトルを記録することによって追跡できます。蛍光スペクトルに必要な励起帯域幅は、通常、CD測定で使用されるスペクトル帯域幅よりも大きいため、CD測定と蛍光測定で異なるスペクトル帯域幅を使用する必要がある場合があります。この二重アプローチにより、さまざまな条件下でのタンパク質の挙動の解釈が強化され、構造および安定性評価の信頼性が向上します。

蛍光データを収集する方法は複数あり、光電子増倍管（PMT）を用いて全蛍光を記録する方法、CCD蛍光光度計を用いて全スペクトル蛍光を記録する方法、または走査型発光分光器（SEM）を用いて一定の励起波長で蛍光スペクトルを走査する方法などがある。

CDは旋光分散（ORD）の技術と密接に関連しています。旋光とは、直線偏光が光学活性物質を通過する際に回転する現象であり、光の左円偏光成分と右円偏光成分の屈折率の差によって生じます（直線偏光は右円偏光と左円偏光の等しい組み合わせと考えることができます）。旋光分散とは、波長による旋光の変化のことです。ORDスペクトルとCDスペクトルはどちらも、偏光（円偏光または直線偏光）とキラル分子との相互作用から生じ、直接関連しています。それぞれは、クラマース・クローニッヒ変換を用いて互いに導出できます。ORDとCDの測定は基本的に同じ情報を提供しますが、実験的にはそれぞれの技術が特定の用途で好まれています。CDは、キラル分子が光を吸収する波長でのみ観測されるため、より高分解能の技術です。これにより、複数の吸収帯を含む複雑なスペクトルの解釈が容易になります。一方、ORD測定は、測定対象のキラル分子が必ずしも光を吸収しない波長で取得できます。これは、ORD測定は高濃度の物質や、溶媒や緩衝塩の吸収によって吸収帯が隠されている物質に対しても実施できることを意味します。ORDは、特に非置換糖類に有効です。なぜなら、この種の生体分子は、市販のCD測定装置で測定可能なUV-Vis領域に吸収を持つ発色団を持たないからです。

適切なアクセサリを使用すれば、CD分光光度計で線形二色性（LD）測定を行うことができます。線形二色性とは、配向軸に平行および垂直に偏光した光の吸光度の差のことです。

ΔA = A _para - A _perp

ここで、Aは直線偏光の吸光度であり、添え字はそれぞれ平行偏光と垂直偏光を示します。サンプルがゼロでないLDを持つためには、異方性である必要があります。異方性は、例えば液晶のように固有のものである場合もあれば、例えばポリマーフィルムの延伸、電場の印加、またはせん断場における配向や変形（例えばDNAなどの核酸）によって誘発される場合もあります。

LD装置は、クエットセルを用いてせん断場を生成する。試料は、同心円状の2つの石英円筒間の環状ギャップに収容され、外側の円筒（ローター）は円筒軸を中心に回転し、内側の円筒（ステーター）は固定されている。この構造は、考案者であるモーリス・クエットにちなんで名付けられた。

せん断によって、液体中の大きな粒子が整列したり変形したりすることがあります。例えば、カーボンナノチューブやガラス繊維のような剛性の高い棒状粒子は整列しますが、小胞、ミセル、柔軟なポリマーは平衡構造から変形し、せん断方向に伸びます。線形二色性を用いることで、吸収された発色団における正味の電子移動の方向をせん断方向に対して決定し、それによって吸収種の整列方向、あるいはその周囲の変形方向を特定することができます。

LDとその測定に関する詳細については、本書を参照してください。^{[ 26 ]}

磁気円二色性（MCD）とは、光の伝搬方向と平行な磁場が存在する状況下で、左円偏光と右円偏光の吸収率が異なる現象である。MCDは、キラルな試料を必要としない点で自然界の円二色性（CD）とは異なり、CDとMCDの起源は大きく異なる。

MCDスペクトルには、A項、B項、C項と呼ばれる3つの成分が寄与している。室温では、特に非磁性発色団の場合、A項とB項が支配的であり、標準的なMCD実験で観測できるスペクトルの大部分を占める。

A項は、スピンの差による縮退励起状態のゼーマン分裂によって生じます。その結果、各スピン状態の紫外可視スペクトルの波長にわずかなずれが生じ、それぞれの状態が左円偏光または右円偏光を優先的に吸収します。A項MCDスペクトルは、吸収ピーク付近に鋭い遷移を持つ吸収遷移の微分として観測されます。A項バンドが存在するため、MCDスペクトルは吸収スペクトルや自然CDスペクトルよりも構造が明確になり、複数の重なり合う発色団をより容易に定量化でき、個々の発色団の変化を追跡することが可能になります。

B項は、非縮退基底状態の混合によって生じる。通常は単一の吸収帯ピークとして観測され、その値は正または負のいずれかとなる。

C項は、常磁性基底状態の磁場に対する応答によって、ゼーマン準位上の分子の分布が変化することに起因する。C項は極低温でのみMCDスペクトルにおいて顕著になり、高磁場強度と極低温という装置要件は、関連技術である電子常磁性共鳴（EPR）の要件と非常によく似ている。これは高価で専用のシステムであり、したがって、卓上型CD装置の容易に交換可能なMCDアクセサリでC項を測定できる範囲を超えている。

MCDデータの収集方法は、磁石の向きが2種類あり、検出器に近い方が北極か南極かという点を除けば、自然CDの収集方法と似ています。通常、磁石をそれぞれの向きにしてスペクトルを取得します。磁場が反転するとスペクトルへのMCD成分の寄与は符号が変わりますが、自然CD成分の寄与は符号が変わらないため、2つのスペクトルを平均化することで両方の寄与を得ることができます。

MCDに関する詳細については、本書を参照してください。^{[ 27 ]}

円偏光発光（CPL）は、円偏光二色性（CD）の発光版です。CDは分子の基底状態における構造を調べるのに対し、CPLは通常、入射光ビームに対して垂直に観測され、分子の励起状態または発光状態における構造に関する情報を提供します。CPL実験では、放出された光に含まれる左円偏光と右円偏光の含有量を分析します。

左円偏光と右円偏光の放射光の強度差ΔIは、次式で与えられる。

ΔI = I _L – I _R​

ここで、I _LとI _{R は}それぞれ左円偏光と右円偏光の発光強度である。平均発光強度は次式で与えられる。

I = ( I _L + I _R ) / 2

ΔIとIはどちらも相対単位です。これは、発光実験ではすべての発光が検出されるわけではなく、限られた立体角内の発光のみが検出されるためです。さらに、発光分子の濃度の絶対値を得ることは困難な場合があります。これらの理由から、発光における非対称性因子は次のように定義されます。

g _lum = Δ I / I

ここで、g _lumは、特定の条件下で各CPL活性分子に固有の絶対値である。

市販されている多くの円偏光二色性分光光度計は、付属品を取り付けることで、試料の円偏光発光を測定できるように改造することができる。

円偏光二色性（CD）分光法を用いて固体試料を分析することは可能である。これにはいくつかの方法がある。

試料は、臭化カリウムや塩化カリウムなどの不活性分散剤で圧縮するか、試料を薄膜としてディスク上に堆積させることで、ディスク状に作製されることが多い。この手法は赤外吸収分光法で広く用いられており、紫外可視分光法でも使用されている。試料は透過モードで測定され、光は試料を透過して分光計の透過ポートに設置された検出器に到達する。異方性の影響を排除するため、試料は通常ホイールに取り付けられ、手動で回転させることで複数の角度位置で測定を行うことができる。その後、すべての位置のスペクトルを平均化する。

固体試料が粉末状である場合は、積分球と呼ばれる装置を用いて拡散反射率を測定することで測定できる。

積分球は20世紀初頭に開発され、当初は光源の方向を考慮せずに光源の全出力を測定するために使用されていました。現在では、固体試料の紫外可視吸収スペクトルや赤外吸収スペクトルを測定する際に広く用いられており、固体の紫外可視円偏光二色性（CD）分光法にも応用されています。

光は入射口から球体に入り、球体の内面は通常白色で反射性があり拡散性があるため、光は多重散乱反射によって球体内に均等に分布します。検出器は出口口に配置され、光の強度が測定されます。円偏光二色性（CD）分光法では、試料は入射口に配置され、光が球体に入る前に試料を通過するか、入射口の反対側の球体上の点に配置され、光が球体に入った後に試料から拡散反射されます。これらの2つの動作モードは、それぞれ透過モードと拡散反射モードと呼ばれます。どちらの場合も、試料は粉末状で準備されます。透過モードの場合、試料は臭化カリウムまたは塩化カリウムに分散され、ディスク状に圧縮されます。拡散反射モードの場合、試料は粉末のままで、必要に応じて硫酸バリウムやポリテトラフルオロエチレン（PTFE）などの希釈剤に分散されます。

市販されている多くの円偏光二色性（CD）分光光度計は、溶液中の高速反応の速度論を研究するためのストップドフロー装置を装備できるように設計されています。この手法の最も単純な形式では、2つの反応物の溶液を混合チャンバーに通すことで急速に混合し、混合液がチャンバーから出てきた後、光学観察セルを通過します。ある時点で流れを突然停止し、吸光度、蛍光、蛍光偏光、円偏光二色性などの適切な分光プローブを使用して反応を監視します。時間に対する分光信号の変化を記録し、適切なモデルを使用してデータをフィッティングすることで、反応速度論を定義する速度定数を得ることができます。