タンパク質の核磁気共鳴分光法

タンパク質の核磁気共鳴分光法（通常、タンパク質NMRと略される）は構造生物学の分野であり、NMR分光法を使用してタンパク質、核酸、およびその複合体の構造と動態に関する情報を取得します。この分野は、ETHのRichard R. ErnstとKurt Wüthrich ^[1]、NIHのAd Bax、Marius Clore、Angela Gronenborn ^[2]、ハーバード大学のGerhard Wagnerらによって開拓されました。NMR分光法による構造決定は通常、それぞれが別個の高度に専門化された技術セットを使用する複数のフェーズで構成されます。サンプルを準備し、測定を行い、解釈アプローチを適用し、構造を計算して検証します。

NMR は、原子の中心核 (「核」)の量子力学的特性に関係します。これらの特性は局所的な分子環境に依存し、その測定により、原子が化学的にどのように結合しているか、空間内で原子がどれだけ近いか、原子が互いに対してどれだけ速く動いているかのマップが得られます。これらの特性は、より一般的な磁気共鳴画像法 (MRI)で使用される特性と基本的に同じですが、分子アプリケーションでは、ミリメートル (放射線科医が関心を持つ) からナノメートル(結合した原子は通常、ナノメートルの数分の 1 の間隔) へのスケールの変更に適した、多少異なるアプローチが使用されます。このスケールの変更には、長期測定のためのはるかに高い検出感度と安定性が必要です。MRI とは対照的に、構造生物学研究では画像を直接生成するのではなく、複雑なコンピューター計算を使用して 3 次元分子モデルを生成します。

現在、ほとんどのサンプルは水溶液で検査されていますが、固体サンプルでも機能する方法が開発されています。データ収集は、サンプルを強力な磁石の中に置き、サンプルに無線周波数信号を送信し、それらの信号の吸収を測定することに依存しています。タンパク質内の原子の環境に応じて、個々の原子の核は異なる周波数の無線信号を吸収します。さらに、異なる核の吸収信号は、隣接する核によって乱される可能性があります。この情報を使用して、核間の距離を決定できます。これらの距離を使用して、タンパク質の全体的な構造を決定できます。

典型的な研究では、2 つのタンパク質がどのように相互作用するかが取り上げられ、相互作用の正常な生物学的性質を調べるために使用できる小分子の開発 (「化学生物学」) や、医薬品としての使用 (医薬品開発)の可能性のある手がかりの提供が目的とされる。相互作用するタンパク質のペアは、ヒト遺伝学の研究によって特定されていることが多く、望ましくない突然変異によって相互作用が阻害される可能性があることが示唆されているか、またはミバエ、酵母、線虫C. elegans、またはマウスなどの「モデル」生物の正常な生物学的性質において重要な役割を果たす可能性がある。サンプルを準備するには、通常、分子生物学の手法を使用して細菌発酵によって量を作る。これにより、分子の同位体組成を変更することもできます。これは、同位体が異なる動作をするため、重なり合う NMR 信号を識別する方法を提供するため、望ましいことです。

タンパク質核磁気共鳴は、高度に精製されたタンパク質の水性サンプルに対して行われます。通常、サンプルは 300 ～ 600 マイクロリットルで、タンパク質濃度は 0.1 ～ 3ミリモルの範囲です。タンパク質の供給源は、天然のものでも、遺伝子工学による組み換え DNA技術を使用した生産システムで生成されたものでもかまいません。組み換え発現タンパク質は通常、十分な量で生産するのが容易であり、この方法により同位体標識が可能になります。^{[引用が必要]}

精製されたタンパク質は通常、緩衝液に溶解され、所望の溶媒条件に調整される。NMRサンプルは薄壁ガラス管で調製される。^[要出典]

タンパク質 NMR は、多次元核磁気共鳴実験を利用してタンパク質に関する情報を取得します。理想的には、分子内の各個別の核は個別の電子環境を経験し、したがって認識できる個別の化学シフトを持ちます。ただし、タンパク質などの大きな分子では、共鳴の数は通常数千になり、1 次元スペクトルには必然的に偶発的な重なりが生じます。そのため、個別の核の周波数を相関させる多次元実験が行われます。次元が追加されると、分子の特定の部分内の核からの信号が相関するため、重なり合う可能性が低くなり、情報量が多くなります。磁化は、電磁 (無線周波数) エネルギーのパルスを使用してサンプルに転送され、遅延を使用して核間に転送されます。このプロセスは、いわゆるパルス シーケンスで説明されます。パルス シーケンスを使用すると、実験者は核間の特定の種類の接続を調査して選択できます。タンパク質に用いられる核磁気共鳴実験の配列は、主に 2 つのカテゴリに分類されます。1 つは磁化が化学結合を介して伝達されるもので、もう 1 つは結合構造に関係なく磁化が空間を介して伝達されるものです。最初のカテゴリは、異なる化学シフトを特定の核に割り当てるために使用され、2 つ目のカテゴリは主に、構造計算やラベルのないタンパク質の割り当てに使用される距離制限を生成するために使用されます。^{[引用が必要]}

サンプルの濃度、分光計の磁場、実験の種類に応じて、タンパク質サンプルに対する単一の多次元核磁気共鳴実験では、信号の平均化によって適切な信号対雑音比を取得し、実験のさまざまな次元を通じて磁化移動を十分に展開させるまでに数時間から数日かかる場合があります。他の条件が同じであれば、高次元の実験は低次元の実験よりも時間がかかります。^{[引用が必要]}

通常、同位体標識タンパク質で測定される最初の実験は、2D異核単一量子相関(HSQC) スペクトルです。ここで、「異核」は 1H 以外の核を指します。理論的には、異核単一量子相関は、異核に結合した各 H に対して 1 つのピークを持ちます。したがって、¹⁵ N標識タンパク質を使用した 15N-HSQC では、プロリンを除いて、骨格の窒素原子ごとに 1 つのシグナルが予想されます。プロリンは、骨格の環状性質によりアミド水素を持ちません。追加の 15N-HSQC シグナルは、側鎖に窒素水素結合を持つ各残基 (W、N、Q、R、H、K) によって寄与されます。各タンパク質には独自のシグナル位置パターンがあるため、15N-HSQC はタンパク質の指紋と呼ばれることがよくあります。 15N-HSQC の分析により、研究者は予想されるピーク数が存在するかどうかを評価し、複数のコンフォメーションやサンプルの不均一性に起因する可能性のある問題を特定できます。比較的迅速な異核単一量子相関実験は、その後のより長く、より高価で、より複雑な実験の実現可能性を判断するのに役立ちます。異核単一量子相関だけでは、ピークを特定の原子に割り当てることはできません。^{[引用が必要]}

核磁気共鳴データを分析するには、タンパク質の共鳴割り当て、つまりどの化学シフトがどの原子に対応するかを知ることが重要です。これは通常、いくつかの異なるタイプの NMR 実験から得られた情報を使用して、順次ウォーキングすることで達成されます。割り当て実験の多くは炭素 13 と窒素 15 に依存するため、正確な手順はタンパク質が同位体標識されているかどうかによって異なります。^{[引用が必要]}

ラベルのないタンパク質の場合、通常の手順は、相関分光法(COSY)による一連の 2 次元同核核磁気共鳴実験を記録することです。相関分光法には、従来の相関分光法、全相関分光法 (TOCSY)、核オーバーハウザー効果分光法 (NOESY) など、いくつかの種類があります。^{[3] [4]} 2 次元核磁気共鳴実験では、2 次元スペクトルが生成されます。両方の軸の単位は化学シフトです。COSY と TOCSY は、隣接する陽子間の化学結合を介して磁化を転送します。従来の相関分光法実験では、隣接する原子上の陽子間でのみ磁化を転送できますが、全相関分光法実験では、陽子が磁化をリレーできるため、隣接する原子で接続されているすべての陽子間で磁化が転送されます。したがって、従来の相関分光法では、アルファ陽子がベータ陽子に磁化を移し、ベータ陽子がアルファおよびガンマ陽子（存在する場合）に磁化を移し、次にガンマ陽子がベータおよびデルタ陽子に磁化を移し、このプロセスが継続されます。全相関分光法では、アルファおよび他のすべての陽子は、連続した陽子鎖でつながっている場合、ベータ、ガンマ、デルタ、イプシロンに磁化を移すことができます。連続した陽子鎖は、個々のアミノ酸の側鎖です。したがって、これら 2 つの実験は、いわゆるスピン システムを構築するために使用されます。つまり、ペプチド陽子、アルファ陽子、および各残基の側鎖のすべての陽子の化学シフトの共鳴のリストを構築します。どの化学シフトがスピン システム内のどの核に対応するかは、従来の相関分光法の接続性と、異なるタイプの陽子が特徴的な化学シフトを持つという事実によって決まります。異なるスピン系を順番に結びつけるには、核オーバーハウザー効果分光実験を使用する必要があります。この実験は磁化を空間を介して転送するため、同じスピン系であるかどうかに関係なく、空間的に近接しているすべての陽子のクロスピークが表示されます。隣接する残基は本質的に空間的に近接しているため、他のスピン系との NOESY のピークによって割り当てを行うことができます。^{[引用が必要]}

同核核磁気共鳴法を使用する際の重要な問題の一つは、ピーク間の重なりです。これは、異なるプロトンが同じまたは非常に類似した化学シフトを持つ場合に発生します。この問題はタンパク質が大きくなるにつれて大きくなるため、同核核磁気共鳴法は通常、小さなタンパク質またはペプチドに限定されます。^{[引用が必要]}

最も一般的に行われている 15N 実験は¹ H- ¹⁵ N HSQC です。この実験は感度が高いため、比較的迅速に実行できます。この実験は、NMR を使用した構造決定に対するタンパク質の適合性の確認や、サンプル条件の最適化によく使用されます。これは、タンパク質の溶液構造を決定するために使用される標準的な実験の 1 つです。HSQC は、¹⁵ N-TOCSY-HSQC や¹⁵ N-NOESY-HSQC などの 3 次元および 4 次元 NMR 実験にさらに拡張できます。^[5]

タンパク質が炭素13と窒素15で標識されている場合、ペプチド結合を介して磁化を移動し、結合を介して異なるスピンシステムを接続するための三重共鳴実験を記録することが可能です。 ^{[6] [7]}これは通常、HNCO、HN(CA)CO、HNCA、^[8] HN(CO)CA、HNCACB、CBCA(CO)NHなどの実験を使用して行われます。 6つの実験はすべて、炭素次元で拡張された^1H - ^15N平面（HSQCスペクトルに類似）で構成されています。HN(CA)COでは、各H _N平面に、その残基のカルボニル炭素からのピークと、シーケンス内の前の残基からのピークが含まれます。HNCOには、前の残基からのカルボニル炭素化学シフトのみが含まれますが、HN(CA)COよりもはるかに感度が高くなります。これらの実験により、各¹ H- ¹⁵ N ピークを先行するカルボニル炭素にリンクすることができ、各スピン システム自身の炭素と先行する炭素のシフトを一致させることによって順次割り当てを行うことができます。HNCAとHN (CO)CA は同様に機能しますが、カルボニルではなくアルファ炭素 (C _α ) で機能し、HNCACBとCBCA(CO)NHにはアルファ炭素とベータ炭素 (C _β ) の両方が含まれます。通常、炭素次元の重なりを解決するには、これらの実験を複数回行う必要があります。この手順は、結合移動を介した結合に基づくため、通常、NOESY ベースの方法よりも曖昧さが少なくなります。NOESY ベースの方法では、空間的に近接しているが連続する残基に属さない原子に対応する追加のピークが表示され、割り当てプロセスが混乱します。最初の連続共鳴割り当てに続いて、通常は、HCCH-TOCSY などの実験を使用して、C _αおよび C _βから側鎖の残りの部分への割り当てを拡張することが可能です。HCCH-TOCSY は、基本的に追加の炭素次元で解決された TOCSY 実験です。

構造計算を行うには、実験的に決定されたいくつかの拘束を生成する必要があります。これらはさまざまなカテゴリに分類されますが、最も広く使用されているのは距離拘束と角度拘束です。

NOESY実験におけるクロスピークは、問題の 2 つの核間の空間的な近接性を示します。したがって、各ピークは核間の最大距離に変換でき、通常は 1.8 ～ 6オングストロームです。NOESY ピークの強度は距離のマイナス 6 乗に比例するため、距離はピークの強度に応じて決定されます。強度と距離の関係は正確ではないため、通常は距離の範囲が使用されます。

化学シフトに基づいてNOESYピークを正しい核に割り当てることは非常に重要です。タンパク質には通常何千ものNOESYピークがあるため、この作業を手動で行うと通常非常に手間がかかります。統合NMRプラットフォーム[19]のPASD ^{[9] [10]} / XPLOR-NIH、^{[11] [12]} UNIO、^[13] CYANA、^[14] ARIA ^[15] / CNS、^[16] AUDANA ^[17] /PONDEROSA-C/S [ ^{18 ]}などの一部のコンピュータプログラムは、手動で前処理されたピーク位置とピーク体積のリストと構造計算を組み合わせて、この作業を自動的に実行します。面倒な繰り返し精製ピークリストを必要とせずに生のNOESYデータに直接アクセスできるのは、これまでのところ、XPLOR-NIHに実装されたPASD ^[10]アルゴリズム、^[11] UNIOソフトウェアパッケージに実装されたATNOS/CANDIDアプローチ、^[13]およびPONDEROSA-C/Sのみであり、客観的で効率的なNOESYスペクトル解析を保証します。

できるだけ正確な割り当てを得るには、炭素 13 と窒素 15 の NOESY 実験を利用できることが大きな利点です。これらの実験は、陽子次元の重なりを解決するのに役立ちます。これにより、割り当てがより速く、より信頼性が高くなり、結果として構造がより良くなります。

距離の制約に加えて、化学結合のねじれ角の制約、通常はpsi 角と phi 角を生成できます。 1 つの方法は、 Karplus 方程式を使用して、結合定数から角度の制約を生成することです。 別の方法は、化学シフトを使用して角度の制約を生成します。 どちらの方法も、アルファ炭素の周りの形状が結合定数と化学シフトに影響を与えるという事実を使用しているため、結合定数または化学シフトがわかれば、ねじれ角について適切な推測を行うことができます。

サンプル中の分析対象分子は、サンプル条件を操作することで、分光計の外部磁場に対して部分的に整列させることができる。一般的な手法としては、サンプルにバクテリオファージまたはバイセルを追加すること、またはサンプルを伸張したポリアクリルアミドゲルで準備することなどがある。これにより、非球状分子の特定の配向に有利な局所環境が作り出される。通常、溶液 NMR では、分子の高速回転により、核間の双極子結合は平均化される。1 つの配向がわずかに過剰になると、残留双極子結合が観察される。双極子結合は固体 NMRで一般的に使用され、単一のグローバル参照フレームに対する結合ベクトルの相対的な配向に関する情報を提供する。通常、NH ベクトルの配向は HSQC のような実験で調べられる。当初、残留双極子結合は、以前に決定された構造の改良に使用されていたが、de novo 構造決定の試みも行われている。^[20]

NMR 分光法は核に特化しています。したがって、水素と重水素を区別できます。タンパク質のアミドプロトンは溶媒と容易に交換され、溶媒に異なる同位体 (通常は重水素)が含まれている場合、反応は NMR 分光法で監視できます。特定のアミドが交換される速さは、溶媒へのアクセスしやすさを反映します。したがって、アミド交換速度は、タンパク質のどの部分が埋め込まれているか、水素結合しているかなどの情報を提供します。一般的な用途は、遊離型と複合体の交換を比較することです。複合体で保護されるアミドは、相互作用インターフェイスにあると想定されます。

実験的に決定された制約は、構造計算プロセスの入力として使用できます。研究者は、XPLOR-NIH、^[11] CYANA、GeNMR、またはRosettaNMR ^[21]などのコンピュータープログラムを使用して、結合長や角度などのタンパク質の一般的な特性に加えて、可能な限り多くの制約を満たすように試みます。アルゴリズムは、制約と一般的なタンパク質特性をエネルギー項に変換し、このエネルギーを最小化しようとします。このプロセスの結果、データが特定のフォールドを指示するのに十分であれば収束する構造のアンサンブルが得られます。

得られた構造の集合は「実験モデル」、つまりある種の実験データの表現である。この事実を認識することは重要である。なぜなら、モデルがその実験データの良い表現になるか悪い表現になるかを意味するからである。^[22]一般に、モデルの品質は、モデルを生成するために使用された実験データの量と品質、およびそのようなデータの正しい解釈の両方に依存する。

すべての実験にはエラーが伴います。ランダム エラーは、結果として得られる構造の再現性と精度に影響します。エラーが体系的である場合、モデルの精度が影響を受けます。精度は、測定の再現性の度合いを示し、多くの場合、同じ条件下で測定されたデータ セットの分散として表されます。ただし、精度は、測定値が「真の」値に近づく度合いを示します。

理想的には、タンパク質のモデルは、それが表す実際の分子に近ければ近いほど正確になり、原子の位置に関する不確実性が少ないほど精密になります。実際には、タンパク質のモデルを比較するための「標準分子」は存在しないため、モデルの精度は、モデルと一連の実験データとの一致度によって決まります。歴史的に、NMR によって決定された構造は、一般に、X 線回折によって決定された構造よりも品質が低くなっています。これは、NMR によって取得されたデータに含まれる情報量が少ないことが一因です。この事実により、同じタンパク質について X 線回折によって決定された固有の構造と比較することによって、NMR アンサンブルの品質を確立することが一般的な方法になっています。ただし、X 線回折構造が存在しない可能性があり、溶液中のタンパク質は柔軟な分子であるため、単一の構造で表されるタンパク質では、タンパク質の原子位置の固有の変動が過小評価される可能性があります。 NMRやX線結晶構造解析によって決定された一連の立体配座は、タンパク質の固有の立体配座よりも実験データをより適切に表現する可能性がある。^[23]

モデルの有用性は、少なくとも部分的には、モデルの正確性と精度の程度によって決まります。比較的精度の低い正確なモデルは、一連のタンパク質の構造間の進化的関係を研究するのに有用ですが、合理的な薬物設計には、正確性と精度の両方のモデルが必要です。正確でないモデルは、それが得られた精度の程度に関係なく、あまり役に立ちません。^{[22] [24]}

タンパク質構造はエラーを含む可能性のある実験モデルであるため、これらのエラーを検出できることが非常に重要です。エラーの検出を目的としたプロセスは検証と呼ばれます。構造を検証する方法はいくつかあり、PROCHECK やWHAT IF などの統計的なものもあれば、 CheShiftなどの物理原理に基づくものや、統計原理と物理原理を組み合わせた PSVS もあります。

構造に加えて、核磁気共鳴はタンパク質のさまざまな部分のダイナミクスに関する情報も提供します。これには通常、秩序パラメータ、相関時間、および化学交換速度を決定するために、T ₁や T ₂などの緩和時間の測定が含まれます。NMR緩和は、分子内の局所的な変動磁場の結果です。局所的な変動磁場は、分子運動によって生成されます。このように、緩和時間の測定により、原子レベルで分子内の運動に関する情報を提供できます。タンパク質ダイナミクスの NMR 研究では、窒素 15同位体が研究に適した核です。その緩和時間は分子運動と比較的簡単に関連付けることができるためです。ただし、これにはタンパク質の同位体標識が必要です。T ₁および T _{2緩和時間は、さまざまな種類の}HSQCベースの実験を使用して測定できます。検出できる運動の種類は、約 10 ピコ秒から約 10 ナノ秒の範囲の時間スケールで発生する運動です。さらに、約 10 マイクロ秒から 100 ミリ秒の範囲の時間スケールで発生する、より遅い動きも研究できます。ただし、窒素原子は主にタンパク質のバックボーンに存在するため、結果は主に、タンパク質分子の最も硬い部分であるバックボーンの動きを反映します。したがって、窒素 15 の緩和測定から得られる結果は、タンパク質全体を代表しない可能性があります。そのため、炭素 13と重水素の緩和測定を利用する技術が最近開発され、タンパク質内のアミノ酸側鎖の動きを体系的に研究できるようになりました。ペプチドと全長タンパク質のダイナミクスと柔軟性に関する研究の困難で特殊なケースは、無秩序な構造によって表されます。今日では、タンパク質が無秩序または構造の欠如として知られるより柔軟な動作を示すことができるという考えが受け入れられていますが、タンパク質の完全な機能状態を表す静的画像の代わりに、構造の集合を記述することは可能です。この分野では、特に新しいパルスシーケンス、技術の向上、この分野の研究者の厳格なトレーニングの面で多くの進歩が見られます。

従来、核磁気共鳴分光法は比較的小さなタンパク質またはタンパク質ドメインに限定されていました。これは、大きなタンパク質の重なり合ったピークを解決する問題に一部起因していますが、同位体標識と多次元実験の導入により緩和されました。もう 1 つのより深刻な問題は、大きなタンパク質では磁化がより速く緩和されるため、信号を検出する時間が短くなることです。これにより、ピークはより広く弱くなり、最終的には消えてしまいます。緩和を減衰させるために、横緩和最適化分光法(TROSY) ^[25]とタンパク質の重水素化^{[26]という 2 つの技術が導入されました。これらの技術を使用することで、900 kDa}シャペロン GroES - GroELと複合体を形成したタンパク質を研究することが可能になりました。^{[27] [28]}

NMR による構造決定は、従来、時間のかかるプロセスであり、高度な訓練を受けた科学者によるデータの対話型分析が必要でした。構造決定のスループットを向上させ、タンパク質 NMR を専門家以外の人にも利用しやすくするために、プロセスを自動化することに大きな関心が寄せられてきました (構造ゲノミクスを参照)。最も時間のかかる 2 つのプロセスは、配列固有の共鳴割り当て (バックボーンおよび側鎖割り当て) と NOE 割り当てタスクです。全体的な NMR 構造決定プロセスの個々の部分を自動化した複数の異なるコンピュータ プログラムが公開されています。自動化された NOE 割り当てのタスクでは、最も大きな進歩が達成されています。これまでのところ、タンパク質 NMR 構造決定プロセス全体を人間の介入なしに自動的に実行するために提案されたのは、FLYA と UNIO アプローチだけです。^{[13] [14]} NMRFAM-SPARKYのモジュール、例えばAPES（2文字コード：ae）、I-PINE/PINE-SPARKY（2文字コード：ep、I-PINEウェブサーバー）、PONDEROSA（2文字コード：c3、up、PONDEROSAウェブサーバー）は統合されており、各ステップで視覚的な検証機能を備えた完全な自動化を提供します。^[29]構造計算プロトコルを標準化して、より迅速かつ自動化しやすいものにする取り組みも行われています。^[30]最近、上記のプログラムの後継であるPOKYスイートがリリースされ、最新のGUIツールとAI / ML機能を提供しています。^[31]

• NMR分光法
• 核磁気共鳴
• 炭水化物の核磁気共鳴分光法
• 核酸の核磁気共鳴分光法
• タンパク質結晶化
• タンパク質ダイナミクス
• 緩和（NMR）
• X線結晶構造解析

• 重水素化なしで巨大タンパク質のバックボーンと側鎖の共鳴を割り当てるための NOESY ベースの戦略 (プロトコル)
• リラックス NMRダイナミクス解析用ソフトウェア
• ProSA-web実験的または理論的に決定されたタンパク質構造のエラーを認識するためのWebサービス。Wayback Machineで2011-05-11にアーカイブ済み
• まばらな実験データからのタンパク質構造決定 - 入門プレゼンテーション
• タンパク質NMR タンパク質NMR実験