蛍光異方性

蛍光異方性または蛍光偏光は、蛍光体から放出される光の強度が異なる偏光軸に沿って不均一になる現象です。この分野の初期の先駆者には、アレクサンダー・ヤブロンスキー、グレゴリオ・ウェーバー、^[1]、アンドレアス・アルブレヒトなどがいます。^[2]蛍光偏光の原理と方法のいくつかの応用は、ラコヴィッツの本で紹介されています。^[3]

光源の異方性（r）は、偏光成分と全強度（）の比として定義される：[ 3 ^]${\displaystyle I_{T}}$

${\displaystyle r={\frac {I_{z}-I_{y}}{I_{x}+I_{y}+I_{z}}}}$

励起がz軸に沿って偏光している場合、蛍光体からの発光はz軸の周りに対称になります（図）。したがって、統計的には となります。、およびの場合、 ${\displaystyle I_{x}=I_{y}}$${\displaystyle I_{y}=I_{\perp}}$${\displaystyle I_{z}=I_{\Parallel }}$

${\displaystyle r={\frac {I_{\parallel }-I_{\perp }}{I_{\parallel }+2I_{\perp }}}={\frac {I_{\parallel }-I_{\perp }}{I_{T}}}}$。

蛍光^[4]では、分子が光子を吸収し、より高いエネルギー状態に励起されます。短い遅延（平均は蛍光寿命として表されます）の後、分子はエネルギーの一部を熱として失い、残りのエネルギーを別の光子として放出することで、より低い状態に戻ります。励起と脱励起には、分子の周りの電子の再分配が伴います。したがって、光子による励起は、光の電場が分子の周りの特定の軸に向いている場合にのみ発生します。また、放出された光子は、分子に対して特定の偏光を持ちます。 ${\displaystyle \tau}$

異方性測定で理解すべき最初の概念はブラウン運動の概念です。ガラスに入った常温の水は目には静止しているように見えますが、分子レベルでは各水分子は運動エネルギーを持っているため、一定時間内に水分子間の衝突が多数発生します。溶液中に浮遊するナノ粒子（図の黄色の点）は、これらの基礎となる衝突の総和によりランダムウォークを起こします。分子が₁ラジアン回転するのにかかる時間である回転相関時間（ Φr ）は、ナノ粒子の粘度（ η ）、温度（T）、_{ボルツマン}定数（kB）、および体積（V ）に依存します。 ^[5]

${\displaystyle \phi _{r}={{\eta V} \over {k{_{B}}T}}}$

2 番目の概念は、偏光を使用した光選択です。ランダムに配向した蛍光体のグループに偏光を当てると、励起された分子のほとんどは、適用された偏光に対して特定の角度範囲内に配向されます。分子が動かない場合、放出された光も、適用された光に対して特定の角度範囲内に偏光します。

単一光子励起の場合、励起双極子と放出双極子が平行のとき、 固有異方性r _{0の理論上の最大値は 0.4 になり、励起双極子と放出双極子が垂直のとき、最小値は -0.2 になります。}

${\displaystyle {r_{0}}={2 \over 5}\left({{3{{\cos }^{2}}\beta -1} \over 2}\right)}$

ここで、β は励起双極子と発光双極子の間の角度です。定常蛍光測定では、通常、蛍光体を凍結ポリオールに埋め込んで測定します。

理想的で最も単純なケースとして、単一指数関数の蛍光寿命を持ち、r ₀ =0.4 である溶液中に懸濁した染料分子のサブセットを取り上げます (吸光度が約 0.05 になるように調製されたエチレングリコール中のローダミン 6g は、適切なテスト サンプルです)。励起が非偏光であれば、測定される蛍光発光も同様に非偏光であるはずです。ただし、励起源が励起偏光子を使用して垂直偏光されている場合は、測定される蛍光に偏光効果が反映されます。これらの偏光アーティファクトは、発光偏光子をマジック アングル54.7º に配置することで対処できます。発光偏光子が垂直偏光の場合、ブラウン運動により染料分子が初期の垂直偏光構成から非偏光構成に移動するため、蛍光がさらに失われます。一方、発光偏光子が水平偏光の場合、最初は垂直偏光でブラウン運動によって脱偏光になった励起分子がさらに導入されます。蛍光の合計と差は、それぞれ強度の加算と蛍光強度の減算によって作成できます。 ${\displaystyle \tau}$

${\displaystyle S={I_{VV}}+2G{I_{VH}}}$

${\displaystyle D={I_{VV}}-G{I_{VH}}}$

差を合計で割ると異方性の減衰が得られます。

${\displaystyle r={D \over S}}$

格子係数Gは、発光光学系の水平方向と垂直方向のどちらが機器に適しているかを示す係数です。これは、励起偏光子を水平方向に移動して、発光偏光子がそれぞれ垂直偏光と水平偏光になっているときの強度を比較することで測定できます。

${\displaystyle G={{I_{HV}} \over {I_{HH}}}}$

Gは発光波長に依存します。文献のG は、示されている逆数として定義されていることに注意してください。

入射光と放射光の偏光の非相関の程度は、蛍光寿命 ( ) と比較して蛍光体の配向がどれだけ速くスクランブルされるか (回転寿命 ) に依存します。配向のスクランブルは、分子全体の回転または蛍光部分のみの回転によって発生します。回転速度は、測定された異方性と Perrin 方程式によって関連付けられます。 ${\displaystyle \phi}$${\displaystyle \tau}$

${\displaystyle r(\tau )={\frac {r_{0}}{1+\tau /\tau _{c}}}}$

ここでrは観測された異方性、r0_は分子の固有の異方性、は蛍光寿命、は回転相関時間である。^[6]${\displaystyle \tau}$${\displaystyle \tau_{c}}$

この分析は、蛍光体が比較的離れている場合にのみ有効です。蛍光体が互いに非常に近い場合、FRETによってエネルギーを交換できます。また、独立して移動する (または配向する) 多数の分子の 1 つから放出が発生する可能性があるため、予想よりも低い異方性またはより大きな非相関性が生じます。このタイプのホモトランスファーフェルスター共鳴エネルギー移動は、エネルギー移動 FRET またはemFRETと呼ばれます。

定常蛍光異方性は「平均」異方性しか示しません。時間分解蛍光異方性^[7]では、減衰時間、残留異方性、回転相関時間をすべて異方性減衰のフィッティングから決定できるため、さらに多くの情報が得られます。通常、励起には垂直パルス レーザー ソースが使用され、レーザーの開始パルス (開始) と蛍光光子の測定 (停止) の間にタイミング エレクトロニクスが追加されます。通常、時間相関単一光子計数 (TCSPC) 技術が使用されます。

再び、理想的で最も単純なケースを使用して、単一指数関数の蛍光寿命と初期異方性 r ₀ =0.4 を持つ溶液中に懸濁した染料分子のサブセットを使用します。サンプルがパルス垂直配向励起源で励起された場合、発光偏光子がマジックアングルにあるときに単一の減衰時間が測定されるはずです。発光偏光子が垂直偏光されている場合は、代わりに 2 つの減衰時間が測定され、両方とも正のプレ指数係数を持ちます。最初の減衰時間は、非偏光発光セットアップで測定されたものと同等で、2 番目の減衰時間は、ブラウン運動により染料分子が初期の垂直偏光構成から非偏光構成に移動する結果として蛍光が失われることによって生じます。一方、発光偏光子が水平偏光されている場合は、2 つの減衰時間が再び回復され、最初の減衰時間は正のプレ指数係数を持ち、 と同等になりますが、2 番目の減衰時間は、最初は垂直偏光で、ブラウン運動により脱分極した励起分子の導入によって生じた負のプレ指数係数を持ちます。蛍光の和と差は、それぞれ減衰の加算と蛍光減衰の減算によって構成できます。 ${\displaystyle \tau}$${\displaystyle \tau}$${\displaystyle \tau}$${\displaystyle \tau}$

${\displaystyle S(t)=G{I_{VV}}(t)+2{I_{VH}}(t)}$

${\displaystyle D(t)=G{I_{VV}}(t)-{I_{VH}}(t)}$

差を合計で割ると異方性の減衰が得られます。

${\displaystyle r(t)={D(t) \over S(t)}}$

最も単純なケースでは、球状染料の種類は 1 つだけです。

${\displaystyle r(t)={r_{0}}\exp \left({-{t \over {\phi _{r}}}}\right)}$

蛍光異方性は、分子の回転時間の変化を引き起こす結合定数と反応速度を測定するために使用できます。蛍光体が小さな分子の場合、大きなタンパク質に結合すると回転速度が大幅に低下する可能性があります。蛍光体が結合ペアで大きなタンパク質に付​​着している場合、結合状態と非結合状態の間の分極の差は小さくなり (非結合タンパク質はすでにかなり安定しており、最初からゆっくりと回転するため)、測定の精度が低下します。結合の程度は、2 つの結合パートナーを滴定して測定された、部分的に結合した状態、自由状態、完全に結合した状態 (タンパク質が大過剰) の異方性の差を使用して計算されます。

蛍光体がタンパク質やRNAのような比較的大きな分子に結合している場合、折り畳みに伴う可動性の変化を利用して折り畳みのダイナミクスを研究することができます。これにより、タンパク質が最終的に安定した3D形状を達成するダイナミクスの尺度が得られます。フェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）を介して相互作用する蛍光体と組み合わせることで、蛍光異方性は複合体形成分子のオリゴマー状態（ 「相互作用している分子はいくつありますか？」）を検出するために使用できます。 ^[8]

蛍光異方性は顕微鏡にも応用されており、照明光の経路とカメラの前に偏光子が使用されています。これは細胞質または膜の局所粘度を調べるのに使用でき、後者は膜の微細構造とさまざまな脂質の相対濃度に関する情報を提供します。この技術は、特定の合図に反応してシグナル伝達カスケードで分子がパートナーに結合するのを検出するのにも使用されています。

emFRET 現象と、蛍光体間で密接な相互作用が起こったときに生じる異方性の減少は、シグナル伝達に応答したタンパク質の凝集を研究するために使用されてきました。

• フェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)
  • 生物発光共鳴エネルギー移動（BRET）
• 磁気異方性
• ペラン摩擦係数