ウレアーゼ

クレブシエラ・アエロゲネス由来のウレアーゼの3Dモデル。2つのNi 2+イオンが緑色の球として示されている。[1]
識別子
EC番号	3.5.1.5
CAS番号	9002-13-5
データベース
インテンズ	IntEnzビュー
ブレンダ	BRENDAエントリー
エクスパス	NiceZyme ビュー
ケッグ	KEGGエントリー
メタサイク	代謝経路
プリアモス	プロフィール
PDB構造	RCSB PDB PDBe PDBsum
遺伝子オントロジー	アミゴー / クイックゴー
検索 個人管理委員会 記事 出版元 記事 国立情報学研究所 タンパク質

ウレアーゼ（EC 3.5.1.5）は、機能的には、アミドヒドロラーゼとホスホトリエステラーゼのスーパーファミリーに属します。 ^{[2]ウレアーゼは、多数の}細菌、真菌、藻類、植物、一部の無脊椎動物、および土壌酵素として土壌に存在します。これらは、高分子量のニッケル含有金属酵素です。 ^[3]

これらの酵素は 尿素を二酸化炭素とアンモニアに加水分解する触媒作用をします。

（NH ₂）₂ CO + H ₂ Oウレアーゼ→CO ₂ + 2NH ₃

尿素の加水分解は2 段階で起こります。第 1 段階では、アンモニアとカルバミン酸が生成されます。カルバミン酸は自発的に急速に加水分解され、アンモニアと炭酸になります。ウレアーゼ活性により、アンモニアが生成され、塩基性になるにつれて、環境の pH が上昇します。

その活性は、1876年にフレデリック・アルフォンス・ムスキュラスによって可溶性発酵物として初めて特定されました。^[4] 1926年、ジェームズ・B・サムナーは、結晶化した形を調べることでウレアーゼがタンパク質であることを示しました。 ^{[5]サムナーの研究は、}タンパク質が酵素として機能できることを初めて実証し、最終的にはほとんどの酵素が実際にはタンパク質であるという認識につながりました。ウレアーゼは結晶化された最初の酵素でした。この研究により、サムナーは1946年にノーベル化学賞を受賞しました。^[6]ウレアーゼの結晶構造は、1995年にPAカルプラスによって初めて解明されました。^[5]

1984年にジャック豆由来のウレアーゼに焦点を当てた研究では、活性部位に一対のニッケル中心が含まれていることが分かりました。 ^[7] ニッケルの代わりにマンガンとコバルトを使用しても、 in vitro活性化が達成されています。 ^[8] 鉛塩は阻害作用があります。

ジャック豆ウレアーゼの分子量は480kDaまたは545kDaです（アミノ酸配列から計算された質量）。分子あたり840個のアミノ酸があり、そのうち90個はシステイン残基です。^[9]

最適pHは 7.4、最適温度は 60 °C です。基質には尿素やヒドロキシ尿素が含まれます。

細菌性ウレアーゼは3つの異なるサブユニットから構成されており、1つの大きな触媒サブユニット（α 60–76kDa）と2つの小さなサブユニット（β 8–21 kDa、γ 6–14 kDa）が一般的に形成され（αβγ）、 2回対称構造を持つ₃三量体の化学量論を形成します（上の画像は、真の生物学的アセンブリの3分の1にあたる非対称ユニットの構造を示しています）。これらはシステインを多く含む酵素であり、酵素モル質量は190kDaから300kDaの間です。^[9]

ヘリコバクター属からは、例外的なウレアーゼが得られます。これらは、2つのサブユニット、α(26–31 kDa)-β(61–66 kDa)で構成されています。これらのサブユニットは、超分子(αβ) ₁₂ ドデカマー複合体を形成します。^[10]繰り返しα-βサブユニットでは、サブユニットの各結合ペアに活性部位があり、合計12の活性部位があります。^{[10]これは、}プロトン依存性尿素チャネルを介して尿素がペリプラズムに入ることを可能にすることで胃酸を中和するという、生存に不可欠な機能を果たします。^{[11]ウレアーゼの存在は、}ヘリコバクター属の診断に使用されます。

細菌性ウレアーゼはすべて細胞質にのみ存在しますが、ヘリコバクター・ピロリのウレアーゼは細胞質活性に加えて宿主細胞に対する外部活性も持っています。対照的に、植物性ウレアーゼはすべて細胞質に存在します。^[9]

真菌および植物のウレアーゼは、同一のサブユニット（それぞれ約 90 kDa）で構成され、最も一般的には三量体および六量体として組み立てられます。たとえば、ジャック豆のウレアーゼには 2 つの構造サブユニットと 1 つの触媒サブユニットがあります。α サブユニットには活性部位が含まれており、分子あたり 840 個のアミノ酸（90 個のシステイン）で構成され、Ni(II) イオンを含まない分子量は 90.77 kDa です。12個のニッケルイオンを含む六量体の質量は 545.34 kDa です。植物ウレアーゼのホモ六量体構造の他の例としては、大豆、キマメ、綿実の酵素が挙げられます。^[9]

注目すべき重要な点は、異なるタイプのサブユニットで構成されているにもかかわらず、細菌から植物、真菌まで、さまざまな起源のウレアーゼは、アミノ酸配列の相同性が高いことです。植物ウレアーゼの単一鎖は、融合したγ-β-α構造に相当します。ヘリコバクターの「α」は通常の細菌のγ-βサブユニットの融合に相当し、「β」サブユニットは通常の細菌のαに相当します。^[9] 3鎖構造は、おそらく祖先から受け継がれたものです。^[12]

尿素分解酵素による尿素処理のk cat / K m は、尿素の無触媒_脱離反応の速度の10 ¹⁴倍である。^[5]自然界でこのような現象が観察される理由は数多くある。尿素が活性部位の活性基に近接している_ことと、尿素の正しい配向により、加水分解が急速に起こる。尿素は、それがとりうる共鳴形態により、単独では非常に安定している。尿素の安定性は、30～40 kcal/molと推定される共鳴エネルギーによるものと理解されている。 ^[5]これは、両性イオン共鳴形態はすべてカルボニル炭素に電子を供与するため、求電子剤ではなくなり、求核攻撃に対する反応性が低くなるためである。^[5]

ウレアーゼの活性部位はα （アルファ）サブユニットにあります。これはビス-μ-ヒドロキソ二量体ニッケル中心で、原子間距離は約3.5Åです。^[5] > Ni(II)ペアは弱い反強磁性結合をしています。^[13] Canavalia ensiformis （ジャックの豆）、Klebsiella aerogenes 、およびSporosarcina pasteurii（以前はBacillus pasteuriiとして知られていました）のX線吸収分光法（XAS）研究^{[14]により、ニッケル1個あたり2つの}イミダゾール配位子を含む、O/Nのみの配位子を持つ5～6配位ニッケルイオンが確認されています。^{[8]尿素基質は}アクア配位子を置換すると提案されています。

活性部位の開口部に位置する水分子は、水素結合を介して空洞部位を満たす四面体クラスターを形成する。いくつかのアミノ酸残基は、基質のゲートとなる部位の可動フラップを形成することが提案されている。^[3]システイン残基は酵素のフラップ領域によく見られるが、これは活性部位の他の重要な残基を適切に配置することに関与しているものの、触媒には必須ではないことが判明している。^[15] Sporosarcina pasteuriiウレアーゼでは、フラップは開いた構造で発見されたが、反応には閉じた構造が必要であることは明らかである。^[14]

比較すると、ヘリコバクター・ピロリのウレアーゼと他の細菌ウレアーゼのαサブユニットはジャック豆のウレアーゼと一致します。^[15]

尿素がウレアーゼの活性部位に結合することは観察されていない。^[9]

ウレアーゼによるこの反応の触媒機構の1つは、BlakeleyとZernerによって提唱された。^{[16]これは、}尿素分子のカルボニル酸素による5配位Ni（Ni-1）への求核攻撃で始まる。弱く配位した水配位子がその場所に置き換えられる。尿素分子の窒素原子の1つからの孤立電子対が中心炭素と二重結合を形成し、結果として生じる配位基質のNH ₂ ^{−が近くの正に帯電した基と相互作用する。BlakeleyとZernerは、この近くの基が}カルボキシレートイオンであると提唱したが、脱プロトン化されたカルボキシレートは負に帯電している。

6 配位の Ni 上の水酸化物配位子は塩基によって脱プロトン化されます。その後、カルボニル炭素は電気陰性酸素によって攻撃されます。窒素-炭素二重結合からの電子対が窒素に戻り、窒素の電荷を中和します。一方、4 配位となった炭素は中間の四面体配向をとります。

この中間体の分解は、活性部位の近くにあるシステインのスルフィドリル基によって促進されます。水素が窒素原子の 1 つに結合し、炭素との結合が切断されてNH ₃分子が放出されます。同時に、酸素と 6 配位ニッケル間の結合が切断されます。これにより、5 配位 Ni に配位したカルバメートイオンが残り、これが水分子に置き換えられて酵素が再生されます。

生成されたカルバメートは自然に分解して別のアンモニアと炭酸を生成する。^[17]

ハウジンガーとカープラスが提案したメカニズムは、ブレイクリーとツェナーの経路に見られる問題のいくつかを修正しようとしており、尿素結合ポケットを構成する側鎖の位置に焦点を当てている。^[5] K. aerogenesウレアーゼ の結晶構造から、ブレイクリーのメカニズムで使用される一般塩基である His ³²⁰は、Ni2 結合水から遠すぎるため、脱プロトン化して攻撃的な水酸化物部分を形成することができないと主張された。さらに、尿素窒素をプロトン化するために必要な一般酸性リガンドは特定されなかった。^{[18]ハウジンガーとカープラスは、逆プロトン化スキームを提案しており、そこでは His 320}リガンドのプロトン化された形態が一般酸の役割を果たし、Ni2 結合水は既に脱プロトン化状態にある。^[5] メカニズムは同じ経路をたどりますが、一般的な塩基は省略され（不要になったため）、His ^{320 が}プロトンを供与してアンモニア分子を形成し、それが酵素から放出されます。His ³²⁰リガンドと結合水の大部分は活性型（それぞれプロトン化および脱プロトン化）ではありませんが、計算によると、尿素分解酵素全体の約 0.3% が一度に活性になります。^[5] 論理的には、これは酵素があまり効率的ではないことを意味しますが、確立された知識に反して、逆プロトン化スキームを使用すると、活性型の反応性が向上するという利点があり、欠点を相殺します。^[5] His ³²⁰リガンドをメカニズムの必須コンポーネントとして配置することは、酵素の可動フラップ領域も考慮に入れています。このヒスチジンリガンドは可動フラップの一部であるため、触媒作用のための尿素基質の結合により活性部位上のこのフラップが閉じ、ポケット内の他のリガンドからの尿素への水素結合パターンの追加により、尿素分解酵素の尿素に対する選択性が示されます。^[5]

^{Ciurli と Mangani [19]}によって提唱されたメカニズムは、尿素分解酵素のメカニズムに関する比較的最近かつ現在受け入れられている見解の 1 つであり、主に活性部位の2 つのニッケルイオンの異なる役割に基づいています。 ^[14]そのうちの 1 つは尿素に結合して活性化し、もう 1 つのニッケルイオンは求核性水分子に結合して活性化します。^[14] この提案では、可動性の「フラップ」（尿素が活性部位に入ることを可能にする）が開いているときに尿素が活性部位の空洞に入ります。尿素の活性部位への結合の安定性は、基質を触媒空洞に配向する水素結合ネットワークを介して達成されます。 ^{[14]尿素は、カルボニル}酸素原子 で 5 配位ニッケル (Ni1) に結合します。尿素は、アミノ基の 1 つで 6 配位ニッケル (Ni2) に近づき、続いて 2 つのニッケル中心を橋渡しします。^[14] 尿素カルボニル酸素原子のNi1への結合は、His ^α222 Nґのプロトン化状態によって安定化される。さらに、可動フラップの開状態から閉状態への構造変化により、Ala ^α222カルボニル基の再配列が生じ、その酸素原子がNi2を指すようになる。^[14] Ala ^α170とAla ^{α366は、カルボニル基が尿素のNH} ₂基に対する水素結合受容体として働くように配向され、Ni2への結合を助ける。^{[14]尿素は、NH} ₂基のルイス塩基性が低いため、キレート配位子として は非常に貧弱である。しかし、Ala ^α170とAla ^α366のカルボニル酸素は、 NH ₂基の塩基性を高め、Ni2への結合を可能にする。^[14]したがって、この提案されたメカニズムでは、活性部位における尿素の配置は、Ni1の近くで水素結合供与体として、またNi2の近くで受容体として機能するように配置されている活性部位残基の構造的特徴によって誘導される。^[14] Ciurli/Manganiメカニズムと他の2つのメカニズムの主な構造上の違いは、架橋水酸化物によって攻撃される窒素、酸素架橋尿素が組み込まれていることである。^[17]

細菌性ウレアーゼは多くの病状の発症機序としてよく知られています。細菌性ウレアーゼは肝性脳症、肝性昏睡、感染性結石、消化性潰瘍と関連しています。^[20]

感染誘発性尿路結石は、ストルバイト（MgNH ₄ PO ₄ •6H ₂ O）と炭酸 アパタイト（Ca ₁₀ (PO ₄ )6•CO ₃）の混合物です。^[20]これらの多価イオンは可溶性ですが、尿素加水分解中に微生物ウレアーゼからアンモニアが生成されると不溶性になり、周囲の環境のpHが約6.5から9に上昇します。 ^[20]結果としてアルカリ化が起こり、結石が結晶化します。^[20]ヒトでは、微生物ウレアーゼであるプロテウス・ミラビリスが感染誘発性尿路結石に最もよく見られます。^[21]

研究によると、ヘリコバクター・ピロリは肝硬変とともに肝性脳症や肝性昏睡を引き起こすことが示されています。^[22] ヘリコバクター・ピロリは 胃に微生物ウレアーゼを放出します。ウレアーゼは尿素を加水分解してアンモニアと炭酸ガスを生成します。細菌は胃に局在しているため、生成されたアンモニアは胃腔から循環器系に容易に吸収されます。^[22]その結果、血液中のアンモニア濃度が上昇し、高アンモニア血症と​​呼ばれる状態になります。ヘリコバクター・ピロリを除菌すると、アンモニア濃度が著しく低下します。 ^[22]

ヘリコバクター・ピロリ菌も消化性潰瘍の原因であり、報告症例の55～68%にその兆候が見られます。^{[23]これは、}病原菌の根絶後に潰瘍出血と潰瘍再発が 減少したことで確認されました。^[23]胃では、尿素加水分解の結果として粘膜内層のpHが上昇し、胃腺と胃腔の間の水素イオンの移動が妨げられます。^[20] さらに、高アンモニア濃度は細胞間タイトジャンクションに影響を与え、透過性を高め、胃の粘膜を破壊します。^{[20] [24]}

尿素は自然環境中に存在し、人工的にも導入されており、世界中で使用されている合成窒素肥料の半分以上を占めています。^[25]尿素は微生物のウレアーゼによって急速に変換されるため、通常は持続しないという観察にもかかわらず、尿素の大量使用は富栄養化を促進すると考えられています。[ 26 ^] 環境中のウレアーゼ活性は、微生物群集の健康状態の指標として測定されることがよくあります。植物がない場合、土壌中のウレアーゼ活性は一般に従属栄養微生物に起因しますが、一部の化学合成独立栄養アンモニウム酸化細菌は、尿素を唯一の炭素、窒素、エネルギー源として成長できることが実証されています。^[27]

尿素ベースの肥料の急速な分解は無駄が多く、環境にも悪影響を及ぼすため、ウレアーゼの阻害は農業において重要な目標です。^[28] フェニルホスホロジアミデートとN- ( n-ブチル)チオリン酸トリアミドは、そのような阻害剤の2つです。^[29]

ウレアーゼは炭酸カルシウムの形成を促進するため、バイオミネラリゼーションにヒントを得たプロセスに潜在的に有用である。^{[30]特に、微生物学的に誘導された炭酸カルシウムの形成は}バイオコンクリートの製造に使用できる。^[31]

酵素として働くことに加えて、一部のウレアーゼ（特に植物由来のもの）は、触媒機能が無効になっても持続する追加効果を持っています。これには、昆虫毒性、真菌の阻害、哺乳類の神経毒性、哺乳類のエンドサイトーシスと炎症性エイコサノイド産生の促進、細菌の走化性の誘導が含まれます。これらの活動は防御機構の一部である可能性があります。^[12]

ウレアーゼの昆虫毒性は、もともとジャック豆ウレアーゼの相同アイソフォームであるカナトキシンで確認された。ペプチドの消化により、この効果に最も関与する 10 kDa の部分が特定され、ジャブレトックスと名付けられた。大豆ウレアーゼの類似部分はソユレトックスと名付けられている。しかし、昆虫に関する研究では、消化を必要とせずタンパク質全体が有毒であることがわかっている。しかし、「ウレトックス」ペプチドは毒性がより濃縮されているため、生物農薬として有望である。^[12]

多くの胃腸または尿路病原体はウレアーゼを生成するため、ウレアーゼの検出は病原体の存在を検出する診断として使用することができます。

ウレアーゼ陽性病原体には以下のものがあります。

• プロテウス・ミラビリスとプロテウス・ブルガリス
• ウレアプラズマ・ウレアリティカム、マイコプラズマ属の近縁種。
• ノカルジア
• コリネバクテリウム・ウレアリティカム
• 日和見菌であるクリプトコッカス属
• ヘリコバクター・ピロリ
• 特定の腸内細菌には、 Proteus spp.、Klebsiella spp.、Morganella、Providencia、およびおそらくSerratia sppが含まれます。
• ブルセラ
• ブドウ球菌
• 黄色ブドウ球菌^[32]

様々な構造ファミリーのウレアーゼ阻害剤が広く知られています。ウレアーゼの阻害は農業だけでなく、 H. pyloriのような病原体が生存メカニズムとしてウレアーゼを生成するため医学的にも興味深いものです。既知の阻害剤の構造クラスには以下が含まれます: ^{[33] [34]}

• 尿素の類似体。最も強力なのは1-(4-クロロフェニル)-3-パルミトイルチオ尿素のようなチオ尿素です。
• ホスホラミデートは農業で最も一般的に使用されています（上記参照）。
• ハイドロキノンとキノン。医学において最も興味深いのは、すでに広く使用されている抗生物質の一種であるキノロンです。
• 植物代謝産物の中には尿素分解酵素阻害剤もあり、その一例としてアリシンが挙げられます。これらは環境に優しい肥料添加物^[35]と天然医薬品の両方としての可能性を秘めています。

1926年にサムナーがアセトン溶媒和と遠心分離法を用いて初めて結晶として単離しました。^[36]現代の生化学ではウレアーゼの需要が高まっています。ジャックの豆の粉、^[37] スイカの種、^[38]エンドウの種^[39]はすべてウレアーゼの有用な供給源であることが証明されています。

• 尿素カルボキシラーゼ
• アロファネート加水分解酵素
• ウレアーゼ試験

• Mobley HL (2001)。「第 16 章: ウレアーゼ」。Mobley HL、Mendz GL、Hazell SL (編)。Helicobacter pylori : 生理学と遺伝学。ワシントン (DC): ASM Press。ISBN 978-1-55581-213-3. PMID  21290719。