電気生理学

光学的電気生理学的技術は、従来の技術の主な限界の一つを克服するために科学者や技術者によって開発されました。従来の技術では、組織内のほぼ一点における電気活動を観察することができました。従来の技術は、分散した現象を単一点として捉えるものでした。生体電気活動の空間分布への関心から、電気的または化学的環境に反応して発光する分子の開発が進められました。その例として、電圧感受性色素や蛍光タンパク質が挙げられます。灌流、注射、または遺伝子発現によって、このような化合物を1つ以上組織に導入することで、電気活動の1次元または2次元分布を観察・記録することが可能になります。

電圧クランプ法を用いることで、実験者は細胞電位を任意の値に「固定」することができます。これにより、任意の電圧において細胞膜を通過するイオン電流の量を測定することが可能になります。これは、ニューロンの膜にあるイオンチャネルの多くが電圧依存性イオンチャネルであり、膜電位が一定の範囲内にある場合にのみ開くため、重要な意味を持ちます。電圧クランプ法による電流測定は、記録電極と細胞膜が充電されて細胞電位が変化する際に生じる過渡的な容量性電流をほぼ同時にデジタル減算することで可能になります。

電流クランプ法は、記録電極を通して細胞に電流を注入することで膜電位を記録する手法です。電圧クランプ法では、膜電位は実験者によって設定されたレベルに保持されますが、電流クランプ法では膜電位は自由に変化し、増幅器は細胞が自発的に、あるいは刺激の結果として生成するあらゆる電圧を記録します。この手法は、細胞に電流が流れた際に細胞がどのように反応するかを研究するために用いられます。これは、例えば、膜イオンチャネルを開くことで作用する神経伝達物質に対するニューロンの反応を理解する上で重要です。

ほとんどの電流クランプアンプは、細胞から記録された電圧変化をほとんど、あるいは全く増幅しません。この「アンプ」は実際には電位計であり、「ユニティゲインアンプ」と呼ばれることもあります。その主な目的は、細胞によって生成される小さな信号（mV 範囲）の電気的負荷を軽減し、低インピーダンスの電子回路で正確に記録できるようにすることです。アンプは、信号の背後にある電流を増加させると同時に、その電流が流れる抵抗を減少させます。オームの法則に基づく次の例を考えてみましょう。1 MΩの抵抗に10ナノアンペアの電流を流すと、10 mV の電圧が生成されます。電位計は、電圧フォロワ回路を使用して、この「高インピーダンス信号」を「低インピーダンス信号」に変換します。電圧フォロワは、入力電圧（大きな抵抗に小さな電流が流れることによって生じる）を読み取ります。次に、大きな電流源（主電源）を持つ並列回路に指示を出し、その並列回路の抵抗を調整して、同じ出力電圧をより低い抵抗で得るようにします。

この技術は、1991 年にノーベル賞を受賞したエルヴィン・ネーアーとベルト・ザクマンによって開発されました。 ^{[ 7 ]}従来の細胞内記録では、細い電極で細胞を刺しますが、パッチクランプ記録では異なるアプローチをとります。パッチクランプマイクロ電極は、先端径が比較的大きいマイクロピペットです。マイクロ電極を細胞の隣に置き、マイクロ電極を通して穏やかな吸引を行い、細胞膜の一部（「パッチ」）をマイクロ電極の先端に引き込みます。ガラス製の先端は、細胞膜と高い抵抗の「シール」を形成します。この構成は「細胞付着」モードと呼ばれ、膜のパッチに存在するイオンチャネルの活動を研究するために使用できます。さらに吸引を加えると、電極先端の小さな膜のパッチが移動し、電極は細胞の残りの部分にシールされたままになります。この「全細胞」モードでは、非常に安定した細胞内記録が可能です。 （鋭利な電極を用いた従来の細胞内記録と比較した場合）欠点としては、細胞の細胞内液が記録電極内の溶液と混ざり合い、細胞内液の重要な成分が希釈される可能性があることが挙げられます。この手法の変種である「穿孔パッチ」法は、これらの問題を最小限に抑えようと試みています。電極先端から膜パッチを移動させるために吸引する代わりに、孔形成剤を用いてパッチに小さな穴を開けることで、タンパク質などの大きな分子が細胞内に留まり、イオンが自由に穴を通過できるようにすることも可能です。また、膜パッチを細胞の残りの部分から引き離すこともできます。この方法により、パッチの膜特性を薬理学的に分析することが可能になります。パッチクランプ法は、記録後に細胞内容物を抽出して遺伝子発現や細胞型との関連における電気生理学的特性を特徴づけるパッチシーケンス法と呼ばれる手法で、RNAシーケンスと組み合わせることもできます。

細胞膜内の電位を細胞内液のイオン組成への影響​​を最小限に抑えて記録したい場合、鋭利な電極を使用することができます。これらのマイクロピペット（電極）は、パッチクランプ用のガラス毛細管から引き伸ばしたものと同様ですが、孔がはるかに小さいため、細胞内液とピペット内の電解質との間のイオン交換はごくわずかです。マイクロピペット電極の電気抵抗は、パッチクランプで使用される細胞内イオン濃度を模倣した塩濃度ではなく、2～4M KClを充填することによって低減されます。^{[ 8 ]}多くの場合、電極の先端には、記録元の細胞を満たし、後で顕微鏡下で形態を確認するために、ルシファーイエローなどのさまざまな種類の色素が充填されます。色素は、色素の極性に応じて、電極に正または負の直流またはパルス電圧を印加することによって注入されます。

半導体電子チップ上のマイクロ電極アレイは、アレイあたり数千から数十万の電極を備え、in vitro神経細胞培養の長期細胞外記録のプラットフォームとして機能したが、^{[ 9 ] [ 10 ]}その機能は、培養中の数千の神経細胞の細胞内記録にも適用できる。^{[ 11 ]}

生きた動物の脳に挿入された電極は、電極先端に隣接するニューロンによって生成される電気活動を検出します。電極が先端サイズが約1マイクロメートルの微小電極の場合、通常は最大で1つのニューロンの活動を検出します。このように記録する方法は一般に「単一ニューロン」記録と呼ばれます。記録される活動電位は細胞内で記録される活動電位と非常によく似ていますが、信号ははるかに小さいです（通常約1mV）。麻酔下および覚醒状態の動物における単一ニューロンの活動の記録のほとんどは、この方法で行われます。生きた動物における単一ニューロンの記録は、脳がどのように情報を処理するかについて重要な知見をもたらしました。例えば、David HubelとTorsten Wieselは、麻酔をかけたネコの一次視覚野の単一ニューロンの活動を記録し、この領域の単一ニューロンが視覚刺激の非常に特定の特性にどのように反応するかを示しました。^{[ 12 ]}ヒューベルとヴィーゼルは1981年にノーベル生理学・医学賞を受賞した。^{[ 13 ]}

電極挿入のために脳を準備するには、コンプレッソム・ビブラトーム、ライカ・ビブラトーム、ミクロトームなどの繊細なスライス装置がよく使用されます。これらの装置は、電極配置に必要な正確で薄い脳切片を得るのに役立ち、神経科学者が記録のために特定の脳領域をターゲットにすることを可能にします。^{[ 14 ]}

電極の先端がやや大きい場合、電極は複数のニューロンによって生成された活動を記録できる可能性があります。このタイプの記録は「マルチユニット記録」と呼ばれることが多く、意識のある動物において、通常の活動中に特定の脳領域の活動の変化を記録するためによく使用されます。このような電極を1つまたは複数近接して記録することで、周囲の細胞の数や、どのスパイクがどの細胞から発生したかを特定できます。このプロセスはスパイクソーティングと呼ばれ、明確なスパイク特性を持つ特定の種類の細胞が存在する領域に適しています。電極の先端がさらに大きい場合、一般的に個々のニューロンの活動を区別することはできませんが、電極は依然として多くの細胞の活動によって生成された場電位を記録することができます。

細胞外電場電位は、多数の細胞の集合的な活動によって生成される局所的な電流のシンクまたはソースです。通常、電場電位は、シナプス伝達による多数のニューロンの同時活性化によって生成されます。右の図は、海馬のシナプス電場電位を示しています。右図の下側のトレースは、シナプス後グルタミン酸受容体を介して細胞内に入る正電荷によって引き起こされる電流シンクに対応する負の波を示し、上側のトレースは、回路を完成させるために細胞（細胞体）から出る電流によって生成される正の波を示しています。詳細については、「局所電場電位」を参照してください。

アンペロメトリーは、炭素電極を用いて生体溶液中の酸化成分の化学組成の変化を記録する手法です。酸化還元は、「スキャン」と呼ばれるプロセスで記録電極の活性表面の電圧を変化させることによって行われます。特定の脳内化学物質は特徴的な電圧で電子を失ったり得たりするため、個々の物質を識別することができます。アンペロメトリーは、神経系および内分泌系のエキソサイトーシスの研究に用いられてきました。ノルエピネフリン（ノルアドレナリン）、ドーパミン、セロトニン（5-HT）など、多くのモノアミン神経伝達物質は酸化されやすい性質を持っています。この方法は、5-HTやドーパミンを細胞に「負荷」させることで、酸化されやすい神経伝達物質を分泌しない細胞にも適用できます。

この電気生理学的手法では、目的のチャネルまたはトランスポーターを含むプロテオリポソーム、膜小胞、または膜断片が、機能化電極上に塗布された脂質単分子膜に吸着されます。この電極は、ガラス支持体、クロム層、金層、およびオクタデシルメルカプタン単分子膜から構成されています。塗布された膜は電極によって支持されているため、固体支持膜と呼ばれます。通常、生物学的脂質膜を破壊する機械的摂動は、SSMの寿命に影響を与えません。容量性電極（SSMと吸着した小胞から構成される）は機械的に非常に安定しているため、その表面で溶液を迅速に交換できます。この特性により、基質/リガンド濃度の急速な変化を適用して、小胞と電極間の容量結合を介して測定される目的のタンパク質の電気発生活性を調べることができます。^{[ 16 ]}

生体電気認識アッセイ（BERA）は、ゲルマトリックスに固定化された細胞の膜電位の変化を測定することにより、様々な化学物質や生物学的分子を定量化する新しい手法です。電極と細胞の界面の安定性が向上するだけでなく、固定化によって細胞の生存能力と生理機能が維持されます。BERAは主にバイオセンサー用途で使用され、細胞膜電位を変化させることで固定化細胞と相互作用する分析対象物を測定します。このように、陽性サンプルをセンサーに添加すると、特徴的な「シグネチャー」のような電位変化が生じます。BERAは、最近開始された欧州全域を対象とした農薬および食品リスク評価プロジェクトであるFOODSCANの中核技術です。^{[ 17 ]} BERAは、ヒトウイルス（B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス）、^{[ 18 ]}獣医病原体（口蹄疫ウイルス、プリオン、ブルータングウイルス）、植物ウイルス（タバコウイルス、キュウリウイルス）^{[ 19 ]}の検出に、特異的、迅速（1～2分）、再現性があり、費用対効果の高い方法で使用されてきました。この方法は、食品中の農薬[ 20 ][ 21 ][ 22 ]やマイコトキシン[ 23 ]などの環境毒素、コルク^{やワイン中の2,4,6-トリクロロアニソール[} 24 ] ^{[ 25 ]}の検出、および^{臨床サンプル中の非常に}低いスーパーオキシドアニオン濃度の測定にも^使用されています。^{[ 26 ] [ 27 ]}

BERAセンサーは2つの部分から構成されています。

• 消耗性生体認識要素
• 人工知能を組み込んだ電子読み出し装置。^{[ 28 ]}

最近の進歩として、膜工学による分子同定（MIME）と呼ばれる技術が開発されました。この技術では、数千個の人工受容体を細胞膜に埋め込むことで、事実上あらゆる目的分子に対して明確な特異性を持つ細胞を構築できます。^{[ 29 ]}

厳密には実験測定ではないものの、タンパク質や生体膜の導電特性をコンピュータ上で調べる方法が開発されている。これらは主に分子動力学シミュレーションであり、脂質二重層のようなモデル系に外部から電圧を印加する。これらの設定を用いた研究では、膜の電気穿孔^{[ 30 ]やチャネルによるイオン輸送[ 31 ]}などの動的現象を研究することができた。

このような手法の利点は、原子シミュレーションが本来的に高い解像度とデータ密度をもたらすことで、能動伝導機構の詳細を高度に把握できる点にある。しかし、モデルの妥当性に関する不確実性や、システムの巨視的特性を再現すると考えられるほど大規模かつ十分な時間スケールにわたるシステムのモデリングにかかる​​計算コストの高さといった重大な欠点も存在する。原子シミュレーションはマイクロ秒領域に近い、あるいはマイクロ秒領域に及ぶ時間スケールにアクセスできる可能性があるものの、これはパッチクランプ法などの実験手法の解像度よりも数桁低い。

最小情報（MI）規格または報告ガイドラインは、臨床研究において特定の目的を達成するために必要なメタデータ（情報）とデータの最小量を規定しています。「神経科学研究に関する最小情報」（MINI）報告ガイドライン文書群は、電気生理学的実験を報告するための一貫したガイドラインを提供することを目的としています。実際には、MINIモジュールは、データセットを公表するために記述する際に提供すべき情報（例えば、使用されたプロトコルについて）のチェックリストで構成されています。^{[ 32 ]}