酵母が同化できる窒素

酵母が同化できる窒素（YAN）は、遊離アミノ窒素（FAN）、アンモニア（NH ₃）、アンモニウム（NH ₄ ⁺ ）の組み合わせで、ワイン酵母 サッカロミセス・セレビシエなどの酵母が発酵中に利用できる。発酵可能な糖である グルコースとフルクトース以外では、窒素は、意図した乾燥点に達する前に発酵が終わらず、異臭や関連するワインの欠陥も発生しないよう、発酵を成功させるために必要な最も重要な栄養素である。このため、ワインメーカーは、利用可能なYAN資源をリン酸二アンモニウム（DAP）などの窒素添加物で補充することが多い。^[1]

しかし、窒素を過剰に加えると、有益なワイン酵母以外の微生物も栄養素を利用できるため、危険が生じることもあります。これには、ブレタノマイセス、アセトバクター、ラクトバチルス属やペディオコッカス属の乳酸菌などの腐敗菌が含まれます。このため、多くのワイナリーでは、分光計を使用するo-フタルジアルデヒド分析法 (NOPA) やフォルモール滴定法など、現在利用可能ないくつかの方法のいずれかを使用して、収穫後および圧搾後にYANを測定します。マスト中の YAN を知ることで、ワインメーカーは発酵を通過させるために必要な添加物の適切な量を計算でき、その後に発生する腐敗菌のために「栄養砂漠」のみを残すことができます。^[2]

ワインメーカーがブドウ果汁中に見るYANの量は、ブドウの品種、台木、ブドウ園の土壌、ブドウ栽培方法（肥料の使用や樹冠管理など）、特定のヴィンテージの気候条件など、さまざまな要素によって異なります。^[3]

YAN は、 S. cerevisiaeが同化できる主な有機（遊離アミノ酸）および無機（アンモニアおよびアンモニウム）窒素源の測定値です。ブドウ果汁とワインには、ペプチド、巨大タンパク質、アミド、生体アミン、ピリジン、プリン、核酸など、いくつかの窒素化合物が含まれていますが、これらは酵母が代謝に直接使用することができません。まとめると、ブドウ果汁の全窒素含有量は 1 リットルあたり 60 ～ 2400 mg の窒素になりますが、この窒素のすべてが同化できるわけではありません。^{[1]大きなペプチドを細胞外で働くことができる小さな成分に分解する}プロテアーゼ酵素がないため、酵母が窒素源として使用できる分子のサイズが制限されます。^{[3] [4]}

ワインメーカーがブドウ果汁中に見るYANの量は、ブドウの品種、台木、ブドウ園の土壌、ブドウ栽培方法（肥料の使用や樹冠管理など）、および特定のヴィンテージの気候条件など、さまざまな要素によって異なります。ボトリティス・シネレア（望ましくは貴腐として知られる）などのカビによる感染により、ブドウ果汁のアミノ酸含有量が最大61％減少する可能性があります。^[1]ワシントン州など一部の地域はYANが低いことで知られており、典型的なヴィンテージでは検査された果汁の90％が400 mg N/L未満であり^[5]、ほぼ4分の1が150 mg N/L未満です。^[2]

ブドウ園では、窒素はブドウの木に硝酸塩（NO ₃ ⁻）、アンモニウム、または尿素として取り込まれ、アンモニアに還元されます。追加の反応により、窒素はグルタミンとグルタミン酸に組み込まれ、最終的に他のアミノ酸と窒素化合物の合成に使用されます。^{[1]収穫後、ブドウに含まれる利用可能な窒素化合物の大部分（約80％）は皮と種子に集中しています。これらの化合物は、}破砕プロセスとマセレーション/スキンコンタクト中にマストに放出されます。^[4]圧搾後でも、各ブドウの実に含まれる最初の窒素含有量の最大80％が搾りかすに残ります。^[3]

YAN を構成する遊離アミノ窒素 (FAN) のうち、アミノ酸のアルギニン、プロリン、グルタミンが最も豊富で、アラニン、トレオニン、セリン、アスパラギン酸がそれに続き、濃度ははるかに低い^[1]が、ほとんどの既知のアミノ酸は微量にブドウ果汁中に含まれています。^[2]通常、プロリンが最も濃縮されており、アミノ酸の総量の最大 30% を占めることがあります。^[4] FAN の正確な量は変動し、遊離アミノ酸に由来する YAN 1 リットルあたり窒素 22 ～ 1242 mg の範囲になります。^[5]

アルギニン、グルタミン、その他のアミノ酸は発酵のごく初期に急速に消費されることが多いが、プロリンは発酵の通常の嫌気性条件では酵母によってまったく消費されない。これは、プロリンの使用に必要な酵素の 1 つが酸化酵素(分子状酸素が必要) であり、もう 1 つがマスト中のアンモニウム (酵母が必要とする同化可能な窒素の別の供給源) の存在によって抑制されるためである。しかし、マストにリン酸二アンモニウムを添加していない、十分に空気を含んだスターター培養物では、嫌気性条件の発酵が始まる前にプロリンがいくらか利用されるのが通常である。 ^[1]ワインメーカーが FAN を測定する場合、プロリンが含まれているかどうかに注意する必要がある。プロリンが含まれていると YAN の測定値が高くなるからである。シャルドネとカベルネ ソーヴィニヨンは、非常に高いプロリン レベルを持つことが知られている2 つのブドウ品種であるが、リースリングとソーヴィニヨン ブランは通常、非常に低いレベルである。^[4]

酵母は、特殊な膜タンパク質と酸性ワイン溶液のpH勾配 (pH 3～4) と酵母細胞内の細胞質のほぼ中性 pHの差を利用した能動輸送プロセスを介して、アミノ酸と小さなペプチド (5アミノ酸残基未満) を細胞内に輸送します。膜内のプロトン共輸送タンパク質は、水素イオンと結合したアミノ酸を取り込み、その後、水素イオンポンプを介して細胞から排出されます。これはエネルギー依存プロセスであり、発酵が進みエタノール レベルが上昇するにつれて、酵母細胞にとってエネルギー的に不利になり、過剰な水素イオンが細胞内に「受動的に漏れ」ます。細胞の水素イオン ポンプは、内部 pH を維持するためにさらに懸命に働かなければならないため、共輸送タンパク質に他のイオンを持ち込まないように信号を送ります。これが、細胞内への窒素の輸送メカニズムが停止するため、発酵後期の窒素添加がほとんどまたはまったく効果がない理由の 1 つです。^[4]

発酵中、アンモニウムは酵母が利用できる同化可能な窒素の主な形態です。^[1]しかし、圧搾時の果汁には、ブドウ畑でブドウの木が受け取った窒素の量に応じて、0〜150 mg/Lのアンモニウム塩が含まれる場合があります。^[4]

細胞内では、無機アンモニアとアンモニウムイオンが一連の化学反応を通じて「固定」され、最終的に有機窒素源のグルタミン酸が生成される。^[2]アンモニウムイオンは、解糖系で使用される酵素の1つに対するアロステリック調節因子としても機能し、酵母細胞が細胞内にグルコースとフルクトースを輸送する方法にも影響を与える可能性がある。^{[4]主要なグルコース輸送システムで使用されるタンパク質の}半減期は12時間であることがわかっている。酵母細胞を「アンモニア飢餓」状態に置いた研究では、システム全体が50時間後に停止した。これは、アンモニア/アンモニウムの不足が発酵停止のリスクを高める可能性があることを示す強力な証拠である。^[3]

グルタチオン（GSH：L-ガンマグルタミル-L-システイニルグリシン）は酵母細胞中に10mMまでの高濃度で存在し、硫黄と窒素の飢餓に対する反応として重要な役割を果たします。^[6]

アンモニアはアセトバクターやマロラクティック発酵に使われる乳酸菌などの細菌には利用されない。^[2]

同化可能な窒素は、ワイン酵母にとって発酵を完全に完了させ、望ましくない副産物（異臭の原因となる硫化水素などの化合物など）を最小限に抑えるために必要な必須栄養素です。発酵の過程で、酵母は最大1000 mg/Lのアミノ酸を使用しますが、必要な量よりはるかに少ないことがよくあります。^{[2]酵母はアミノ酸を細胞内}液胞に貯蔵し、後で直接使用してタンパク質に組み込むか、分解して炭素と窒素の成分を別々に使用します。^[4]

窒素がなければ、酵母は活動を停止し、死滅し始めます。一部の菌株は、システインやメチオニンなどの硫黄含有アミノ酸を分解し、硫黄原子を放出し、これが水素と結合して硫化水素（H
₂S ) はワインに腐った卵のような臭いを与えることがあります。しかし、酵母は窒素が豊富でも他の重要な栄養素 (ビタミンのパントテン酸など) が不足していても H ₂ S を生成するため、YAN レベルと硫化水素生成には直接的な相関関係はありません。S . cerevisiaeの中には、利用可能な窒素が多すぎる (特にグルタミン酸とアラニンが多すぎる) ことに反応してH _{2 S を生成する菌株もあります}^[3]。このため、すべての発酵に無差別に窒素を補給するという予防的アプローチでは、H ₂ S を防ぐという望ましい結果が得られない可能性があります^{。 [2]}

ワインの窒素レベルは、多くの芳香族化合物の合成を含む、ワインの多くの感覚的側面に影響を与える可能性があります。フーゼルアルコールはアミノ酸の分解によって生成されますが、アンモニアと尿素のレベルが高いと、その生成は減少します。利用可能な窒素が限られていると、口当たりに影響を与える可能性のあるグリセロールとトレハロースのレベルが高くなります。^[3]

必要な YAN の量は、ワインメーカーの発酵の目的、特に自然発酵が望ましいかどうか、またはワインが完全に乾燥するまで発酵するかどうかによって異なります。ブドウの状態と発酵条件は、必要な窒素の量に影響します。損傷、カビ、または灰色カビ病に感染した果実は、通常、ブドウ園から持ち込まれたときに、きれいで無傷のブドウよりも窒素（およびその他のビタミン源）が枯渇しています。この枯渇は、マストの過剰な清澄化と高糖度によってさらに悪化する可能性があります。高温で発酵したワインは、発酵が速く進む傾向があり、より長く低温で発酵した場合よりも多くの窒素を必要とします。また、酸素への露出量も酵母による窒素吸収率に影響し、完全な嫌気性条件で発酵したワイン（ステンレススチールタンクで発酵する多くの白ワインなど）は、樽やオープントップ発酵槽で発酵したワインよりも窒素を必要としません。^[7]

醸造学者が推奨する範囲は、1リットルあたり150 mg YAN ^{[8]から窒素400 mg/Lまでさまざまです。 [9]}いくつかの研究では、YANが400～500 mg N/Lの範囲で最大発酵速度を達成できることが示されています。^{[10]しかし、すべてのワインメーカーが、酵母バイオマス、温度、速度の観点から最大速度での発酵を望んでいるわけではありません。これは、ワインの}香りの発達や果実の保持など、ワインの他の感覚的側面に影響を及ぼす可能性があるためです。^[3]

カリフォルニア大学デービス校ブドウ栽培・醸造学部の研究では、多くの酵母や栄養素の製造業者が採用している収穫時の 糖度レベルに基づいて、発酵を成功させるための最適な窒素レベルに関する推奨事項を作成できることがわかりました。^{[11] [12]}

• 21°Bx = 200 mg N/L
• 23°Bx = 250 mg N/L
• 25°Bx = 300 mg N/L
• 27°Bx = 350 mg N/L

しかし、他の研究では、YANレベルがこれらの推奨値を下回っていても発酵が成功することや、YANレベルが推奨値と一致していても発酵が遅くなったり停滞したりすることが示されています。^[1]

酵母と同様に、マロラクティック発酵に使用される乳酸菌（LAB）（一般的にはOenococcus oeni）は窒素を必要とする。しかし、S. cerevisiaeとは異なり、LABはアンモニアを利用できず、リン酸二アンモニウム（DAP）などの添加物には栄養上の利点がない。ワインメーカーがMLF接種の栄養添加物として誤ってDAPを使用すると、ブレタノマイセスなどの腐敗菌に栄養を与えてしまうリスクがある。^[2]

ワインメーカーの中には、窒素を含む栄養素をLABに接種する人もいますが、MLFに必要な栄養素のほとんどは、死んだ酵母細胞の分解（または自己分解）から得られます。さらに、MLFで使用されるほとんどの細菌は、細胞外プロテアーゼ酵素を生成する能力があり、これにより、より大きなペプチド鎖を代謝に使用できる基本アミノ酸残基に分解することもできます。^[4]

o-フタルジアルデヒドによる窒素分析（NOPA）は、 335 nmの波長で測定できる分光光度計を使用して、ブドウジュース中の利用可能な一次アミノ酸を測定するために使用されます。この分析では一次アミノ酸のみを測定するため、結果にはプロリンやアンモニアの濃度は含まれません。^[13]プロリンは、ギ酸の存在下でニンヒドリンをアミノ酸と反応させて517 nmで吸収される化合物を生成する分析で別途測定できます。^[1]

1907年にデンマークの化学者SPLソレンセンが発明したホルムアルデヒド滴定法は、水酸化カリウムまたは水酸化ナトリウムの存在下でホルムアルデヒドを使用し、 pHメーターを使用してアミノ酸濃度とアンモニアを測定します。試薬はプロリンとも反応するため、NOPAよりもわずかに高いYAN測定値が得られます。^{[14]正式な方法には、}発がん性物質として知られているホルムアルデヒド^[15]と、非常に毒性の高い試薬である塩化バリウム^[1]の使用と廃棄を伴うという欠点もあります。

アンモニアとアンモニウムはイオン選択電極プローブとpHメーターを使用して測定できます。^[1]

ワイン醸造家は、別のワインの搾りかす（圧搾後に残った固い皮、種、残渣）を醸造に添加すると、発酵がより予測可能になり、「より健康的」になることを長い間知っていました。これは、イタリアワインの リパッソを作るのに今日でも使用されている方法です。14世紀のトスカーナでは、最も初期のキャンティのいくつかで使用されたガバナーの技法では、醸造に乾燥したブドウが添加されていました。^[16]これにより糖分も追加されましたが、どちらの方法も、皮や種にまだ残っている窒素やその他の栄養素を余分に供給しました。^[17]

醸造学者が発酵の科学をより深く理解し始めると、窒素が主要な栄養素であることが判明し、ワインメーカーは1900年代初頭からワインの原料にアンモニウム塩を加え始めました。 ^[4] 尿素も初期の窒素補給剤として使用されていましたが、尿素とエチルカルバメートの開発との関連を示す研究により、 1990年以降、米国を含む多くの国で禁止されています。 ^{[2] [18] [19]}

ワインメーカーが使用できる窒素サプリメントには多くの種類があります。そのほとんどは、ビタミン、ミネラル、その他の成長因子とともに窒素（アミノ酸またはアンモニウム塩由来）を含む複合配合物で、Go-Ferm、Superfood、Fermaid K（後者2つにはDAPも含まれています）などのブランド名で販売されています。^[2]アミノ酸はマストに直接添加できますが、2010年現在、米国ではグリシンのみがマストへの添加が許可されています。 ^[4]

酵母殻（または酵母ゴースト）は、接種用酵母株の商業生産から残った酵母細胞壁の残骸です。アミノ酸から同化可能な窒素源を提供することに加えて、細胞が細胞膜を強化するために使用できる脂質とステロールも提供し、他の窒素源の摂取を可能にします。^[2]

窒素補給、特にDAPは酵母の繁殖を刺激し、バイオマスを大幅に増加させます。その結果、ワインメーカーが望むよりも早く発酵速度が加速し、酵母によって発生する熱により発酵温度も上昇します。バイオマスが過剰になると、競争が激しくなり、ビタミンやステロールなどの他の酵母栄養素が不足し、異臭（硫化水素など）が発生したり、発酵が停滞したりする可能性があります。^[1]

アミノ酸アルギニンの濃度が過剰になると（400 mg/L以上）、特に発酵の終わり近くにはエチルカルバメートの生成が増加するリスクがあります。これはアルギニンが尿素に分解され、それが酵母に再吸収されて利用されるか、アンモニアに代謝されるためです。しかし、尿素は完全に代謝されないとエタノールとも反応し、長期暴露（および高温）と相まってエステルエチルカルバメートの生成につながる可能性があります。^[1]

しかし、マストに過剰に栄養分を補給することの最大のリスクは、発酵が完了した後に余分な窒素やその他の栄養素が残ってしまうことです。腐敗菌がこれらの余分な栄養素を利用することで、微生物の不安定性が生じる可能性があります。^[3]

アメリカ合衆国では、アルコール・タバコ税貿易局（TTB）が窒素添加物としてのリン酸二アンモニウムの使用を968 mg/L（8ポンド/1000ガロン）に制限しており、これはYANとして203 mg N/Lとなる。欧州連合では、ほとんどの国が国際ブドウ・ワイン機構（OIV）のガイドラインに従っており、300 mg/Lの制限を定めている。オーストラリアでは、制限は無機リン酸のレベルに基づいており、最大400 mg/Lのリン酸が許容されている。^[2]

ほとんどの栄養剤が、マスト中のすべての生きた微生物に栄養を与えるため（望ましいかどうかにかかわらず）、ワインメーカーは、マストに望ましいS. cerevisiae株を接種する準備ができるまで、栄養剤の添加を待つことがよくあります。天然発酵を使用している生産者は、二酸化硫黄の添加で不要な微生物が死滅するまで待ったり、他の微生物がワインに加える可能性のある複雑さを望んで早めに栄養剤を添加することもあります。添加される窒素は通常、アミノ酸の形で、ビタミンやミネラルと組み合わさって発酵を促進します。^[2]

接種後すぐに、酵母は利用可能な同化可能な窒素を急速に消費し始め、発酵が本格的に始まるまでにYANの最大46%が完全に消費されます。^[1] DAPのアンモニウム塩などの無機窒素は、高濃度では酵母に有毒であるため、新たに再水和した酵母のバイオマスが低い接種中は、決して追加されません。多くのワインメーカーは、DAPの投与量を分割し、最初の追加は、酵母が指数関数的に増殖し、アルコール発酵が始まるラグフェーズの終わりに行います。ほとんどのマストでは、これは接種後約48〜72時間です。 2回目の添加は、糖発酵の3分の1ほどが経過した時点で、糖度が12～10ブリックス（6.5～5.5ボーメ、48.3～40.0エクスレ）に達する前に行われることが多い。これは、発酵が進むにつれて、細胞を取り囲むエタノールの毒性が増すため、酵母細胞が窒素を細胞内に取り込むことができなくなるためである。これにより、窒素は未使用のまま残り、その後に発生する可能性のある腐敗菌に利用可能となる。^{[2] [3]}