ジデオキシヌクレオチド

ジデオキシヌクレオチドはDNAポリメラーゼの鎖伸長阻害剤であり、 DNA配列決定のサンガー法で使用されます。^[1]リボースの2'位と3'位の両方にヒドロキシル基がないため、2',3'とも呼ばれ、 ddNTP（ddGTP、ddATP、ddTTP、ddCTP）と略されます。 ^[2]

サンガー法における役割

サンガー法は、DNAの標的セグメントを増幅し、DNA配列を正確に決定するために使用される。反応バルブへのddNTPの組み込みは、単に成長中のDNA鎖の合成を停止するために使用されるだけであり、部分的に複製されたDNA断片が生じる。これは、DNAポリメラーゼが、リン酸ジエステル結合を形成するために、成長中の鎖の3' OH基と入ってくるdNTPの5' リン酸基を必要とするためである。^[2] DNAポリメラーゼはddNTPを組み込み、3' OH基の不在により、入ってくるヌクレオチドの5' リン酸（ピロリン酸の切断後）と成長中の鎖上の前のヌクレオチドの3' ヒドロキシル基との縮合反応が中断されることがある。この縮合反応は通常、DNAポリメラーゼによる非修飾dNTPの組み込みによって起こる。簡単に言えば、3'OH基の求核攻撃により、成長中の鎖にヌクレオチドが追加されます。3'ヒドロキシル基が存在しないと、この求核攻撃は発生せず、DNAポリメラーゼの機能を継続できなくなります。^[2]

この発見により、この分子は「連鎖終結ヌクレオチド」という適切な名前が付けられました。^[2]ジデオキシリボヌクレオチドには 3' ヒドロキシル基がないため、このジデオキシヌクレオチドが鎖上にあればそれ以上の鎖伸長は起こりません。これにより DNA 配列が終結します。したがって、これらの分子は DNA配列決定のジデオキシ連鎖終結法の基礎を形成し、これは1977 年にフレデリックサンガーと彼のチームによって以前の研究の延長として報告されました^[3]^[4] 。サンガーのアプローチは 2001 年に DNA 断片を配列決定するための 2 つの基本的な方法の 1 つとして説明されました^[1] (もう 1 つはマクサム–ギルバート法^[5] ) が、サンガー法は「最も広く使用されている方法であり、ほとんどの自動 DNA シーケンサーで使用されている方法」です。^[1] サンガーは1980年にウォルター・ギルバート（「核酸の塩基配列の決定に関する貢献」）とポール・バーグ（「特に組み換えDNAに関する核酸の生化学の基礎研究」）と共に2度目のノーベル化学賞を受賞し、^[6]ノーベル賞受賞記念講演でジデオキシヌクレオチドの使用について議論した。^[7]

DNA配列解析

ジデオキシヌクレオチドは、電気泳動と組み合わせた DNA の配列決定に有用である。4 つのデオキシヌクレオチドすべてと 1 つのジデオキシヌクレオチドを含む混合物でPCR (ポリメラーゼ連鎖反応) を行なった DNA サンプルは、ジデオキシヌクレオチドが存在するタイプを補完するタイプの各塩基の位置に等しい長さの鎖を生成する。PCRで使用されるtaq ポリメラーゼがddGNTP を好むことは、さまざまな研究で観察されているパターンである。^[8]つまり、その特定のタイプの各ヌクレオチド塩基は、デオキシヌクレオチドではなくジデオキシヌクレオチドに結合する可能性があり、これにより鎖の伸長が終了される。したがって、サンプルを電気泳動にかけると、ジデオキシヌクレオチドの補完物が存在する長さごとにバンドが存在する。現在では、4 つのそれぞれが異なる蛍光を発し、シーケンサーで検出できるように蛍光ジデオキシヌクレオチドを使用するのが一般的であり、必要な反応は 1 つだけである。

生産

特許取得済みの方法では、ウリジン（またはおそらく保護されていないヌクレオシド） 50 g（0.205 モル）、オルトギ酸メチル112 ml（1.03 モル）、およびパラトルエンスルホン酸10 g（52.6 ミリモル）を含む溶媒中でテトラヒドロフランを使用し、室温で撹拌した。室温で24時間撹拌した後、反応混合物を重炭酸ナトリウム水溶液に注ぎ、クロロホルムで5回抽出した。抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して、2',3'-o-メトキシメチリデンウリジン49.5 g（0.173 モル）（収率84.5%）を得た。この反応の後、ウリジンの例の生成物2',3'-o-メトキシメチリデンウリジンを、室温で撹拌しながら無水酢酸50 mlに溶解する。溶液を140℃に加熱し、溶媒を還流しながらこの温度で5時間保った。室温まで冷却した後、溶媒を減圧下で蒸留して除去し、水50mlを加え、混合物をクロロホルム100mlで3回抽出した。抽出物を減圧下、30%アンモニア水で濃縮し、2',3'-ジデオキシ-2',3'-ジデヒドロウリジンを82.3%の収率で得た。この生成物例を次に、触媒（湿潤5%パラジウム担持炭素）（400mg）を含むメタノール（10ml）に水素雰囲気下で1時間溶解して水和し、二重結合を除去して、結果として得られるジデオキシヌクレオシド（この場合は2',3'-ジデオキシウリジン）を得る。^[6]使用する色素核酸は、リン酸化酵素処理とビオチン化、ビオチン化物質と色素の反応により生成されるものと考えられる。色素との即時反応も起こり得るが、変異型DNAポリメラーゼを使用する場合は、アームを延長すると効率が向上するとされている。^[5]

参考文献

^ abc Meis RJ、Raghavachari R (2001)。「DNA の配列決定と分析における近赤外線の応用」。Raghavachari R (編)。バイオテクノロジーにおける近赤外線の応用。CRC Press。pp . 133–150。ISBN 9781420030242。
^ abcd Watson JD、Baker TA、Bell SP、Gann A、Levine M、Losick R (2014)。遺伝子の分子生物学（第7版）。コールドスプリングハーバー、ニューヨーク：ピアソン。pp. 160–161。ISBN 978-0-321-76243-6。
^ Sanger F、 Nicklen S、 Coulson AR (1977 年 12 月)。「連鎖停止阻害剤による DNA シークエンシング」。米国科学アカデミー紀要。74 (12): 5463–7。Bibcode :1977PNAS... 74.5463S。doi : 10.1073 / pnas.74.12.5463。PMC 431765。PMID 271968 。
^ Sanger F 、 Coulson AR (1975年5月)。「DNAポリメラーゼによるプライム合成によるDNA配列の迅速な決定法」。Journal of Molecular Biology。94 ( 3): 441–8。doi :10.1016/0022-2836(75)90213-2。PMID 1100841 。
^ ab Maxam AM、Gilbert W (1977年2月)。「DNA配列決定のための新しい方法」。米国科学アカデミー紀要。74 (2):560–4。Bibcode : 1977PNAS ...74..560M。doi : 10.1073 / pnas.74.2.560。PMC 392330。PMID 265521。
^ ab Kungliga Vetenskapsakademien (スウェーデン王立科学アカデミー) (1980年10月14日). 「1980年のノーベル化学賞」. nobelprize.org (プレスリリース). Nobel Media . 2018年10月31日時点のオリジナルよりアーカイブ。 2019年12月14日閲覧。
^ Sanger, F. (1980年12月8日). 「DNAのヌクレオチド配列の決定（ノーベル講演）」（PDF） . nobelprize.org .ノーベルメディア. 2019年12月14日時点のオリジナルよりアーカイブ（PDF）。 2019年12月14日閲覧。
^ Li Y, Mitaxov V, Waksman G (1999年8月). 「ジデオキシヌクレオチドの取り込み特性を改善したTaq DNAポリメラーゼの構造ベース設計」.米国科学アカデミー紀要. 96 (17): 9491–6. Bibcode :1999PNAS...96.9491L. doi : 10.1073/pnas.96.17.9491 . PMC 22236. PMID 10449720.

外部リンク

ウィキメディア・コモンズのジデオキシヌクレオチドに関連するメディア

[MeisRaghavachari-1] Meis RJ、Raghavachari R (2001)。「DNA の配列決定と分析における近赤外線の応用」。Raghavachari R (編)。バイオテクノロジーにおける近赤外線の応用。CRC Press。pp . 133–150。ISBN 9781420030242。

[Watson_2014-2] Watson JD、Baker TA、Bell SP、Gann A、Levine M、Losick R (2014)。遺伝子の分子生物学（第7版）。コールドスプリングハーバー、ニューヨーク：ピアソン。pp. 160–161。ISBN 978-0-321-76243-6。

[3] Sanger F、 Nicklen S、 Coulson AR (1977 年 12 月)。「連鎖停止阻害剤による DNA シークエンシング」。米国科学アカデミー紀要。74 (12): 5463–7。Bibcode :1977PNAS... 74.5463S。doi : 10.1073 / pnas.74.12.5463。PMC 431765。PMID 271968 。

[4] Sanger F 、 Coulson AR (1975年5月)。「DNAポリメラーゼによるプライム合成によるDNA配列の迅速な決定法」。Journal of Molecular Biology。94 ( 3): 441–8。doi :10.1016/0022-2836(75)90213-2。PMID 1100841 。

[:0-5] Maxam AM、Gilbert W (1977年2月)。「DNA配列決定のための新しい方法」。米国科学アカデミー紀要。74 (2):560–4。Bibcode : 1977PNAS ...74..560M。doi : 10.1073 / pnas.74.2.560。PMC 392330。PMID 265521。

[:1-6] Kungliga Vetenskapsakademien (スウェーデン王立科学アカデミー) (1980年10月14日). 「1980年のノーベル化学賞」. nobelprize.org (プレスリリース). Nobel Media . 2018年10月31日時点のオリジナルよりアーカイブ。 2019年12月14日閲覧。

[7] Sanger, F. (1980年12月8日). 「DNAのヌクレオチド配列の決定（ノーベル講演）」（PDF） . nobelprize.org .ノーベルメディア. 2019年12月14日時点のオリジナルよりアーカイブ（PDF）。 2019年12月14日閲覧。

[8] Li Y, Mitaxov V, Waksman G (1999年8月). 「ジデオキシヌクレオチドの取り込み特性を改善したTaq DNAポリメラーゼの構造ベース設計」.米国科学アカデミー紀要. 96 (17): 9491–6. Bibcode :1999PNAS...96.9491L. doi : 10.1073/pnas.96.17.9491 . PMC 22236. PMID 10449720.