プロトコルの概要 酵素消化 ：まず、ゲノムDNAをMspIなどのメチル化非感受性制限酵素で消化します。 酵素がCpG のメチル化状態の影響を受けないことが不可欠です。これにより、メチル化領域と非メチル化領域の両方を消化できます。この酵素は5’CCGG3’特定の配列を標的とし、 CpGジヌクレオチドの上流にあるホスホジエステル結合 を切断します。この酵素を使用すると、各断片の両端にCpGが存在します。この消化により、さまざまなサイズのDNA断片が生成されます。末端修復とAテーリング ：MspIが二本鎖DNAを切断する性質上、この反応では粘着末端 を持つ鎖が生成されます。末端修復は、鎖の末端の3'末端を埋めるために必要です。次のステップは、プラス鎖とマイナス鎖の 両方にアデノシンを1つ追加することです。これはAテーリングと呼ばれ、次のステップでのアダプターライゲーションに必要です。末端修復とAテーリングは、dCTP、dGTP、dATPデオキシリボヌクレオチドを用いて同じ反応内で行われます。Aテーリングの効率を高めるために、この反応ではdATPを過剰に添加します。配列アダプター ：メチル化された配列アダプターをDNA断片に連結します。メチル化アダプターオリゴヌクレオチド は、亜硫酸水素塩処理反応におけるシトシンの脱アミノ化を防ぐため、すべてのシトシンを5'-メチルシトシンに置換しています。Illuminaシーケンサーを用いたシーケンス反応では、配列アダプターはフローセル上のアダプターにハイブリダイズします。断片の精製 ：精製のために目的のサイズの断片を選択します。異なるサイズの断片はゲル電気泳動によって分離され、ゲル切除によって精製されます。Guらによると、40～220 塩基 対のDNA断片は、プロモーター配列とCpGアイランド の大部分を代表するものです[ 2 ]。 亜硫酸水素塩変換：次に、DNA断片は亜硫酸水素塩変換されます。これは、メチル化されていないシトシンを ウラシル に脱アミノ化するプロセスです。メチル化されたシトシンは、メチル基が 反応から保護しているため、変化しません。PCR増幅 ：亜硫酸水素塩処理されたDNAは、配列アダプターに相補的なプライマーを用いて PCR により増幅される。PCR精製 ：シーケンス解析を行う前に、PCR産物から未反応のdNTPや塩類などの反応試薬を除去する必要があり、精製が必要です。これは、別の電気泳動ゲルを用いるか、PCR精製専用のキットを使用することで行うことができます。シーケンス解析 ：断片は、要求されるスループット、精度、および処理時間に応じてシーケンス解析されます。当初はサンガーシーケンス法 が用いられていましたが、現在では次世代シーケンス法の方が好まれています。バイオインフォマティクス解析 : RRBS の独自の特性のため、アライメントと解析には特別なソフトウェアが必要です。[ 3 ] MspI を使用してゲノム DNA を消化すると、常に C (シトシンがメチル化されている場合) または T (シトシンがメチル化されておらず、亜硫酸水素塩変換反応でウラシルに変換された場合) で始まる断片が得られます。これにより、非ランダムな塩基対構成になります。さらに、サンプル内の C と T の偏った頻度により、塩基構成が偏っています。アライメントと解析には、Maq、BS Seeker、Bismark、BSMAP など、さまざまなソフトウェアが利用可能です。参照ゲノム へのアライメントにより、プログラムはゲノム内のメチル化された塩基対を特定できます。
利点
CpGの濃縮 RRBSは、特定の制限酵素を使用してCpGを濃縮するという独自の方法を採用しています。MspI消化、またはCpGを認識して切断する任意の制限酵素では、末端にCGを持つ断片のみが生成されます。[ 2 ] [ 2 ]
還元表現型ビスルフィットシーケンスプロトコル
正確なデータ解析には、 10～300 ng の低濃度のサンプルのみ が必要です。[ 2 ] [ 2 ]
制限事項
制限酵素 具体的なプロトコル手順には、いくつかの制限もあります。MspI消化はゲノムのCG領域の大部分をカバーしますが、すべてではありません。[ 2 ] [ 2 ] [ 4 ]
PCR PCR プロトコルでは、校正機能のないポリメラーゼを使用する必要があります。校正機能のある酵素は、ssDNA テンプレートに含まれるウラシル残基で停止してしまうためです。[ 1 ] [ 1 ]
亜硫酸水素塩シーケンス ビスルフィット シーケンシングは、一本鎖 DNA (ssDNA) のみを変換します。完全なビスルフィット変換には、徹底的な変性と再アニーリングした二本鎖 DNA (dsDNA) の不在が必要です。[ 1 ] [ 5 ] もう一つの提案された手法は、高温でも DNA の分解が起こるにもかかわらず、ビスルフィット反応を 95 °C で実行することです。 [ 5 ] [ 6 ] [ 5 ] [ 1 ] [ 1 ]
意義 この技術の重要な点は、従来のビスルフィットシーケンス技術では適切にプロファイリングできないメチル化領域のシーケンスを可能にすることです。現在のシーケンス技術は、反復配列領域のプロファイリングに関して制限があります。[ 7 ] 癌ゲノムのプロファイリングを含む研究にとって特に制限となります。 [ 8 ]
アプリケーション
がんゲノムにおけるメチローム がんでは異常なメチル化が観察されている。[ 9 ] [ 9 ] [ 10 ] [ 2 ] [ 10 ] [ 2 ]
発生過程におけるメチル化状態 あらゆる生物において、発生段階特有の変化が観察される。還元型バイサルファイトシーケンス法によるメチル化レベル全体の変化は、発生生物学において有用である。
他の手法との比較 RRBSとMethylC-seqの結果を比較すると、両者は非常に一致している。[ 11 ] [ 11 ] [ 11 ] [ 11 ] [ 7 ] [ 7 ]
最後に、アンカーベースビスルフィットシーケンス（ABBS）は、Active MotifのBen Delatteグループによって開発されました。この技術は、DNAメチル化を捕捉する特殊なプライマーを使用することで、カバレッジの向上（WGBSの約10倍）とシーケンスコストの削減を実現しています。また、ABBSはRRBSほど制約がなく、塩基解像度を維持しながらMeDIP-seqの代替として使用できることも示されました。[ 12 ]
参考文献 1 2 3 4 5 6 Alexander Meissner、Andreas Gnirke、George W. Bell、Bernard Ramsahoye、Eric S. Lander、Rudolf Jaenisch。2005年。「比較高解像度DNAメチル化解析のための還元表現型ビスルフィットシーケンス」。Nucleic Acids Res . 33(18):5868-77 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Gu H、Smith ZD、Bock C、Boyle P、Gnirke A、Meissner A. 2011. "ゲノムスケールDNAメチル化プロファイリングのための縮小表現ビスルフィットシーケンスライブラリの調製." Nat Protoc . 6(4):468-81. doi : 10.1038/nprot.2010.190 . ↑ Chatterjee A、Rodger EJ、Stockwell PA、Weeks RJ、Morison IM. 2012. 「多重ライブラリを用いた縮小表現型ビスルフィットシーケンスの技術的考察」 J Biomed Biotechnol . 2012:741542. doi : 10.1155/2012/741542 ↑ Trucchi, Emiliano; Mazzarella, Anna B.; Gilfillan, Gregor D.; Lorenzo, Maria T.; Schönswetter, Peter; Paun, Ovidiu (2016 年 4 月). "BsRADseq: 非モデル生物の自然集団における DNA メチル化のスクリーニング" . Molecular Ecology . 25 (8): 1697– 1713. doi : 10.1111/mec.13550 . PMC 4949719 . PMID 26818626 . 1 2 3 Warnercke, PM Stirzaker, C., Song, J., Grunau, C., Melki, JR, Clark, SJ 2002. "亜硫酸水素塩シーケンスにおけるアーティファクトの同定と解決." Methods. 27: 101-107. ↑ Grunau, C., Clark, SJ および Rosenthal, A. 2001. "Bisulfite genomic sequencing: systematic investigation of critical experimental parameters." Nucleic Acids Res ., 29, E65–65. 1 2 3 Bock C、Tomazou EM、Brinkman AB、Müller F、Simmer F、Gu H、Jäger N、Gnirke A、Stunnenberg HG、Meissner A. 2010. 「ゲノムワイドDNAメチル化マッピング技術の定量的比較」 Nat Biotechnol . 28(10):1106-14. doi : 10.1038/nbt.1681 ↑ Ehrlich M. 2009. "がん細胞におけるDNA低メチル化". Epigenomics . 1(2):239-59. doi : 10.2217/epi.09.33 . 1 2 Veersteeg, R. 1997. がんにおける異常メチル化。American Journal of Human Genetics. 60:751-754. 1 2 Smith, ZD、Gu, H.、Bock, C.、Gnike, A.、Meissner, A. 2009. 哺乳類ゲノムにおけるハイスループットビスルフィットシーケンス。Methods . 48: 226-232. 1 2 3 4 Harris, Alan et al. 2010. “DNAメチル化プロファイルとモノアレルエピジェネティック修飾の同定のためのシーケンスベースの方法の比較” Nature Biotechnology 28:1097-1105. ↑ Chapin, N., Fernandez, J., Poole, J. et al. アンカーベースのビスルフィットシーケンスによりゲノム全体のDNAメチル化が決定される。Commun Biol 5, 596 (2022). 
