融解曲線分析

融解曲線分析は、加熱中の二本鎖DNAの解離特性を評価するものです。温度が上昇すると、二本鎖が解離し始め、吸光度、濃色度が上昇します。DNA の 50% が変性する温度は、融解温度と呼ばれます。融解温度を測定すると、融解温度を調べるだけで種を予測できます。これは、すべての生物が特定の融解曲線を持っているためです。

収集された情報を使用して、一塩基多型(SNP) の存在とアイデンティティを推測できます。これは、GC 塩基対には 3 つの水素結合があるのに対し、AT 塩基対には 2 つしかないためです。A または T から C または G への変異を持つ DNA は、より高い融解温度を生み出します。

この情報は、分子が DNA とどのように相互作用するかについての重要な手がかりも与えてくれます。インターカレーターなどの分子は塩基対の間に入り込み、π スタッキングを介して相互作用します。これは DNA の構造を安定化させる効果があり、融点の上昇につながります。同様に、塩分濃度の上昇は DNA の骨格にあるリン酸間の負の反発を拡散するのに役立ちます。これも DNA の融点の上昇につながります。逆に、pH は DNA の安定性に悪影響を及ぼし、融点の低下につながる可能性があります。

2 本の DNA 鎖間の塩基間水素結合を切断するために必要なエネルギーは、鎖の長さ、GC 含有量、および相補性によって異なります。二本鎖 DNA 配列を含む反応混合物を加熱し、温度に対する解離を測定することで、これらの属性を推測できます。

^{もともと、鎖解離は紫外線吸光度測定[1]}を使用して観察されていましたが、現在では蛍光測定に基づく技術^[2]が最も一般的なアプローチとなっています。

2本のDNA鎖間の温度依存的な解離は、SYBRグリーン、EvaGreen、または蛍光標識DNAプローブなどのDNA挿入 蛍光体を使用して測定できます。SYBRグリーン（2本のDNA鎖の副溝に挿入されると1000倍の強度で蛍光を発します）の場合、加熱中のDNAの解離は、結果として生じる蛍光の大幅な減少によって測定できます。^[3]あるいは、並置されたプローブ（1つは蛍光体、もう1つは適切なクエンチャー）を使用して、プローブとターゲット配列の相補性を決定することができます。^[3]

融解曲線の負の一次導関数のグラフでは、このようにして形成されたピークにより、解離温度（50% 解離として定義）を正確に特定しやすくなります。

SYBR Green は1997 年に LightCycler での製品の差別化を可能にしました。 ^[4]ハイブリダイゼーション プローブ (または FRET プローブ) は、一本鎖 (ss) プローブとアンプリコンのハイブリッドから非常に特異的な融解曲線を提供することも実証されています。Idaho Technology と Roche は、LightCycler 機器でのこの使用を普及させるために多大な貢献をしました。

1990 年代後半以降、SYBR Green やその他の二本鎖特異的色素による産物分析、またはプローブベースの融解曲線分析がほぼ普及しました。プローブベースの技術は、一塩基多型 (SNP) を検出できるほど感度が高く、生成される解離パターンによってホモ接合 野生型、ヘテロ接合およびホモ接合変異対立遺伝子を区別できます。プローブがない場合、アンプリコン融解 (PCR 産物全体の融解と分析) では、融解プロファイルから単一塩基変異体を見つけることは一般的にできませんでした。解像度の高い機器と高度な色素により、現在では市販されているいくつかの機器で 1 塩基変異体のアンプリコン融解分析が可能です。たとえば、Applied Biosystems 7500 Fast System および 7900HT Fast Real-Time PCR System、Idaho Technology の LightScanner (最初のプレートベースの高解像度融解装置)、Qiagen の Rotor-Gene 機器、および Roche の LightCycler 480 機器などです。

文献には、融解曲線解析を使用することでシーケンス作業を不要にしたり補完したりしてコストを削減できることを示す 研究例や臨床例が多数存在しています^{[5] 。}

ほとんどの定量PCR装置には融解曲線の生成と分析のオプションがありますが、分析のレベルとソフトウェアのサポートはさまざまです。高解像度融解(Hi-Res Melting、またはHRMとも呼ばれます) は、この一般的な技術の進歩であり、染料で染色されたアンプリコン全体内でのSNP検出の感度を高め始めています。プローブレス融解曲線システムの開発は、コストが低く、設計も簡単です。ただし、大量のサンプルを処理する必要があるジェノタイピングアプリケーションでは、開発コストよりも全体のスループットと解釈のしやすさが重要になる場合があり、プローブベースのジェノタイピング方法が有利になります。

デジタル高解像度融解法（dHRM）^[6]は、デジタルPCR（dPCR）と組み合わせて使用​​​​され、増幅されたDNAの融解挙動に関する追加情報を提供することで定量力を向上させ、異なる遺伝子変異を区別し、定量の精度を確保するのに役立ちます。 ^[7] dHRMは、高感度DNA結合色素とデジタルPCR機器の使用によって可能になり、高密度のデータポイントを収集して詳細な融解プロファイルを生成できます。これらのプロファイルを使用して、核酸配列の微妙な違いも識別できるため、dHRMはジェノタイピング、変異スキャン、メチル化分析の強力なツールになります^[8]

dHRMは、二本鎖DNAの融解挙動をモニタリングすることで、一塩基多型（SNP）、突然変異、メチル化などの遺伝的変異を分析するために使用される高度な分子技術です。^[9]これは、PCR増幅されたDNAを、二本鎖DNAに結合すると蛍光を発する挿入色素の存在下で徐々に加熱するポストPCR法です。DNAが融解すると蛍光が減少し、デジタルPCRシステムで蛍光の変化をリアルタイムでモニタリングします。得られた融解曲線を分析し、DNA断片の融解温度に基づいて遺伝的差異を検出します。

この技術は、デジタルマイクロ流体プラットフォームへの応用によってさらに進歩し、一塩基多型（SNP）を高精度かつ高感度に分析できるようになりました。^[10]さらに、迅速かつ絶対定量的な配列プロファイリングを可能にする大規模並列dHRMが開発されており、これは核酸の正確な定量が重要な臨床および産業現場で特に有用です。^[11]

• 高解像度溶融分析
• マイクロスケール熱泳動法は、DNAとRNAの安定性、長さ、構造、修飾を決定する方法である^[12]
• 核酸の熱力学

• Ririe, KM; Rasmussen, RP; Wittwer, CT (1997). 「ポリメラーゼ連鎖反応中の DNA 融解曲線の分析による生成物の差別化」Anal Biochem . 245 (2): 154–160. doi :10.1006/abio.1996.9916. PMID  9056205.
• Lo, Patcick CH (2014-10-21). 「瞬間: 融解曲線分析」。BioTechniques 。2014-10-21に閲覧。