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分子生物学において、制限酵素断片長多型（RFLP）は、相同DNA配列の変異（多型と呼ばれる）を利用して、個体、集団、または種を区別し、配列内の遺伝子の位置を特定する技術である。この用語は、制限酵素部位の位置の違いによって検出される多型そのものを指す場合もあれば、そのような違いを視覚化できる関連する実験技術を指す場合もある。RFLP分析では、DNAサンプルを1つ以上の制限酵素で断片化し、得られた制限断片をゲル電気泳動によってサイズ別に分離する。
RFLP解析は、安価なDNAシーケンス技術の登場により現在ではほとんど使われなくなっているが、広く応用できるほど安価になった最初のDNAプロファイリング技術であった。RFLP解析は、ゲノムマッピング、遺伝性疾患の原因遺伝子の特定、疾患リスクの判定、および親子鑑定において、初期の重要なツールであった。
RFLP検出の基本的な手法は、制限酵素を用いてDNAサンプルを断片化することです。制限酵素は、制限消化と呼ばれるプロセスにおいて、短い特定の配列が認識される箇所でDNA分子を選択的に切断します。消化によって生成されたDNA断片は、アガロースゲル電気泳動と呼ばれるプロセスによって長さごとに分離され、サザンブロット法によってメンブレンに転写されます。メンブレンを標識DNAプローブとハイブリダイゼーションさせることで、プローブに相補的な断片の長さが決定されます。制限断片長多型は、検出された断片の長さが個体間で異なる場合に発生すると言われ、これは配列相同性が同一ではないことを示しています。各断片の長さは、実際にコード領域を含むかどうかにかかわらず、アレルとみなされ、その後の遺伝子解析に使用できます。
特定の制限断片のサイズが変化する一般的なメカニズムは 2 つあります。最初の模式図では、ゲノムの小さなセグメントがDNA プローブ (太線) によって検出されています。対立遺伝子Aでは、ゲノムは制限酵素によって 3 つの近接した部位 (三角形) で切断されますが、プローブによって検出されるのは最も右側の断片のみです。対立遺伝子aでは、制限部位 2 が突然変異によって失われているため、プローブは部位 1 から 3 まで続くより大きな融合断片を検出します。2 番目の図は、この断片サイズの変動がサザンブロットでどのように見えるか、また、各対立遺伝子 (個人につき 2 つ) が家族のメンバーにどのように遺伝するかを示しています。
3 番目の模式図では、プローブと制限酵素は、可変数タンデムリピート(VNTR) セグメント (模式図の四角) を含むゲノム領域を検出するように選択されています。対立遺伝子cでは、VNTR に 5 つのリピートがあり、プローブは 2 つの制限部位間のより長い断片を検出します。対立遺伝子dでは、VNTR に 2 つのリピートしかないため、プローブは同じ 2 つの制限部位間のより短い断片を検出します。挿入、欠失、転座、逆位などの他の遺伝的プロセスも多型を引き起こす可能性があります。RFLP テストでは、ショートタンデムリピート(STR) テストよりもはるかに多くの DNA サンプルが必要です。
ゲノムにおけるRFLP変異の解析は、かつてゲノムマッピングや遺伝性疾患解析において重要なツールでした。研究者が特定の疾患遺伝子の染色体上の位置を最初に特定しようとする場合、その疾患に罹患した家族のメンバーのDNAを解析し、疾患と同様の遺伝パターンを示すRFLPアレルを探します（遺伝的連鎖を参照）。疾患遺伝子の位置が特定されると、他の家族のRFLP解析によって、誰がその疾患のリスクがあるか、あるいは誰が変異遺伝子の保因者である可能性が高いかを明らかにすることができました。RFLP検査は、ゲノム内の固有のパターンを解析することによって、生物の識別と区別に使用されます。また、制限酵素部位間の遺伝子座における組換え率の特定にも使用されます。
RFLP分析は、初期の遺伝子指紋鑑定法の基礎でもあり、犯罪現場から採取された試料の識別、父子関係の判定、動物集団における遺伝的多様性や繁殖パターンの特性評価などに役立った。
しかし、RFLP分析の手法は時間がかかり、煩雑です。大量のサンプルDNAが必要であり、プローブ標識、DNA断片化、電気泳動、ブロッティング、ハイブリダイゼーション、洗浄、オートラジオグラフィーの複合プロセスを完了するのに最大1か月かかる場合があります。オリゴヌクレオチドプローブを使用したRFLP法の限定版は1985年に報告されました。[ 1 ]ヒトゲノムプロジェクトの結果により、RFLPマッピングの必要性はほぼなくなり、同プロジェクトで多くの単一ヌクレオチド多型（SNP）が同定されたこと（および多くの疾患遺伝子と変異が直接同定されたこと）により、RFLP疾患連鎖解析の必要性がなくなりました（SNPジェノタイピングを参照）。VNTRアレルの分析は継続されていますが、現在では通常、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法によって行われます。たとえば、DNAフィンガープリンティングの標準プロトコルでは、12個以上のVNTRのパネルのPCR分析が含まれます。
RFLPは、マーカー支援選抜で今も使用されています。末端制限断片長多型（TRFLPまたはT-RFLPとも呼ばれる）は、当初、混合種サンプル中の細菌群集を特徴付けるために開発された技術です。この技術は、土壌真菌を含む他のグループにも適用されています。TRFLPは、蛍光タグで標識されたプライマーペアを使用してDNAをPCR増幅することによって機能します。PCR産物は、RFLP酵素を使用して消化され、結果として得られたパターンはDNAシーケンサーを使用して可視化されます。結果は、TRFLPプロファイルのバンドまたはピークを単純にカウントして比較するか、1つ以上のTRFLP実行からのバンドを既知の種のデータベースと照合することによって分析されます。バンドのマッチング、比較、およびTRFLPプロファイルのデータベース化のプロセスを自動化するために、さまざまなソフトウェアツールが開発されています。[ 2 ]
この技術は、温度勾配ゲル電気泳動（TGGE）や変性勾配ゲル電気泳動（DGGE）といくつかの点で類似している。
RFLPに直接関与する配列変化は、PCRによってより迅速に解析することもできる。増幅は、変化した制限酵素部位をまたいで行われ、増幅産物は制限酵素で消化される。この方法は、切断増幅多型配列（CAPS）法と呼ばれている。あるいは、増幅された断片をアレル特異的オリゴヌクレオチド（ASO）プローブで解析することもでき、この方法は多くの場合、簡単なドットブロット法で実施できる。