核の暴走

核ランオンアッセイは、ある時点で転写されている遺伝子を特定するために行われます。約100万個の細胞核を単離し、標識ヌクレオチドとともにインキュベートし、抽出したRNAをブロット上の遺伝子特異的プローブとハイブリダイズさせることで、転写中の遺伝子を検出します。^[1] Garcia-Martinezら(2004) ^[2]は、酵母S. cerevisiae用のプロトコル(ゲノムランオン、GRO)を開発しました。このプロトコルでは、すべての酵母遺伝子の転写速度(TR)を計算し、すべての酵母mRNAのmRNA安定性を推定できます。^[3]

最近、代替のマイクロアレイ法が開発されました。主に PolII RIP チップです。これは、リン酸化 C 末端ドメインを標的とした抗体による RNA ポリメラーゼ II のRNA 免疫沈降と、マイクロアレイ スライドまたはチップ上でのハイブリダイゼーションです (チップという名前は、特別なAffymetrix GeneChip が必要だった「ChIP チップ」に由来しています)。ランオンと ChIP チップに基づく方法の比較が酵母で行われました (Pelechano ら、2009 年)。両方の方法の一般的な対応が検出されましたが、GRO の方が感度が高く定量的です。ランオンは伸長中の RNA ポリメラーゼのみを検出するのに対し、ChIP チップはバックトラックされたものも含め、存在するすべての RNA ポリメラーゼを検出することを考慮する必要があります。

サルコシルの挿入により、新しいRNAポリメラーゼが遺伝子に結合するのを防ぐことができます。そのため、すでにRNAポリメラーゼを持つ遺伝子のみがラベル付き転写産物を生成します。ラベルの追加前に合成されたRNA転写産物は、ラベルがないため検出されません。これらの転写産物は、ラベルを検出する抗体を使用してラベル付き転写産物を精製し、これらの単離された転写産物を遺伝子発現アレイとハイブリダイズするか、次世代シーケンシング（GRO-Seq）によって検出することもできます。^[4]

ランオンアッセイは、次世代 DNA シーケンシングを読み出しプラットフォームとして使用するグローバル ランオンアッセイに大きく取って代わられました。これらのアッセイはGRO-Seqとして知られ、定量的な発現レベルで転写に関与する遺伝子の非常に詳細なビューを提供します。グローバル ランオン (GRO) アッセイを分析するためのアレイ ベースの方法は、遺伝子配列に対するプローブの設計を排除する次世代シーケンシングに置き換えられつつあります。シーケンシングでは、データベースに報告されていない場合でも、生成されたすべての転写産物がカタログ化されます。GRO-seq では、新しく合成された転写産物をブロモウリジン (BrU) で標識します。細胞または核を BrUTP とともにサルコシルの存在下でインキュベートします。サルコシルは、RNA ポリメラーゼが DNA に結合するのを防ぎます。したがって、サルコシルを追加する前にすでに DNA 上にある RNA ポリメラーゼのみが、BrU で標識される新しい転写産物を生成します。標識された転写産物は抗BrU抗体標識ビーズで捕捉され、cDNAに変換され、次世代DNAシーケンシングによって配列決定されます。その後、シーケンシングリードはゲノムに整列され、転写産物あたりのリード数から合成された転写産物の数を正確に推定できます。^[5]