蛍光タグ

分子生物学およびバイオテクノロジーにおいて、蛍光タグ（蛍光ラベルまたは蛍光プローブとも呼ばれる）は、タンパク質、抗体、アミノ酸などの生体分子の検出を助けるために化学的に付着される分子である。一般に、蛍光タグ付けまたは標識付けには、蛍光分子の反応性誘導体であるフルオロフォアを使用する。フルオロフォアは、標的分子の特定の領域または官能基に選択的に結合し、化学的または生物学的に付着することができる。^{[1]酵素標識、}タンパク質標識、遺伝子標識 などのさまざまな標識技術が広く利用されている。エチジウムブロマイド、フルオレセイン、緑色蛍光タンパク質が一般的なタグである。最も一般的に標識される分子は、抗体、タンパク質、アミノ酸、ペプチドであり、これらは特定の標的を検出するための特異的プローブとして使用される。^[2]

生体分子を検出および識別する方法の開発は、分子構造と相互作用の研究を改善する能力によって動機付けられてきました。蛍光標識の出現以前は、放射性同位元素が分子化合物の検出と識別に使用されていました。それ以来、生体分子を標識および識別する手段として、蛍光染料または蛍光タンパク質をタグまたはプローブとして使用する、より安全な方法が開発されました。^[3] この点での蛍光標識は最近になって利用されるようになりましたが、蛍光の発見はずっと以前から存在していました。

ジョージ・ストークス卿は1852年にストークスの蛍光の法則を考案しました。これは、蛍光放射の波長が励起放射の波長よりも長いというものです。リチャード・マイヤーは1897年に蛍光に関連する化学基を表すために蛍光体と名付けました。それ以来、フルオレセインは1871年にアドルフ・フォン・バイヤーによって蛍光染料として作成され、染色法は1911年の蛍光顕微鏡の開発とともに開発され利用されました。 ^[4]

エチジウムブロマイドとその変種は1950年代に開発され、^[4] 1994年に蛍光タンパク質またはFPが導入されました。^[5] 緑色蛍光タンパク質またはGFPは、1960年代に下村脩によって発見され、1987年にダグラス・プラッシャーによってトレーサー分子として開発されました。 ^{[6] FPは、遺伝子タンパク質領域を選択的にタグ付けし、タンパク質の機能とメカニズムを観察する能力を備えた生}細胞イメージング のブレークスルーをもたらしました。^[5]このブレークスルーにより、下村は2008年にノーベル賞を受賞しました。^[7]

生体分子を追跡するための新しい方法が開発されており、比色バイオセンサー、フォトクロミック化合物、生体材料、電気化学センサーの使用が含まれます。蛍光標識も一般的な方法であり、その応用は酵素標識、化学標識、タンパク質標識、遺伝子標識にまで拡大しています。 ^[1]

現在、生体分子を追跡するための標識方法はいくつかあります。その方法のいくつかを以下に示します。

同位体マーカーが使用される一般的な種にはタンパク質が含まれます。この場合、炭素、窒素、または水素のいずれかの安定同位体を持つアミノ酸がポリペプチド配列に組み込まれます。^{[8]次に、これらのポリペプチドを}質量分析にかけます。これらの同位体がペプチドに引き起こす変化は正確に定義されているため、分光グラフを通じてどのペプチドに同位体が含まれているかを知ることができます。そうすることで、グループ内のいくつかのタンパク質から目的のタンパク質を抽出できます。同位体化合物は、以下で説明するように、フォトクロムとして重要な役割を果たします。

バイオセンサーは対象物質に取り付けられます。通常、この物質は光を吸収できませんが、取り付けられたバイオセンサーを使用すると、光を吸収して分光光度計で放出することができます。^[9]さらに、蛍光バイオセンサーは肉眼で見ることができます。一部の蛍光バイオセンサーは、環境の変化に応じて色を変える機能も備えています（例：青から赤へ）。研究者は、バイオセンサー分子ハイブリッド種から目に見える色に基づいて、周囲の環境を調査し、データを取得できます。^[10]

比色分析は通常、ある種の濃度が他の種と比較してどの程度であるかを判断するために使用されます。^[9]

フォトクロミック化合物は、さまざまな色を切り替える能力を持っています。異なる色を表示する能力は、光の吸収方法にあります。分子の異なる異性体発現は異なる波長の光を吸収するため、各異性体種は吸収に基づいて異なる色を表示できます。これには、特定の環境下で非蛍光状態から蛍光状態に切り替えることができるタンパク質である光スイッチ化合物が含まれます。^[11]

フォトクロムとして使用される最も一般的な有機分子はジアリールエテンである。^[12] 光スイッチ可能なタンパク質の他の例としては、PADRON-C、rs-FastLIME-s、bs-DRONPA-sなどがあり、植物細胞と哺乳類細胞の両方で使用して、細胞が異なる環境に移動するのを観察することができる。^[11]

蛍光バイオマテリアルは、外部要因を利用して経路をより視覚的に観察できる可能性のある方法です。この方法では、生物の自然な経路を変えるペプチド分子を蛍光標識します。このペプチドを生物の細胞に挿入すると、異なる反応を誘発することができます。この方法は、たとえば患者を治療し、治療結果を視覚的に確認するために使用できます。^[13]

電気化学センサーは、生体分子のラベルフリーセンシングに使用できます。電気化学センサーは、プローブされた金属電極とターゲット分析物を含む電解質との間の変化を検出し、電流を測定します。次に、フィードバック電流から既知の電位を電極に適用し、結果として生じる電流を測定できます。たとえば、電気化学センシングを使用する1つの技術には、電圧をゆっくりと上昇させて、電極の化学種を酸化または還元することが含まれます。セル電流対電圧がプロットされ、最終的に電極で消費または生成された化学種の量を特定できます。^[14]蛍光タグは、生物システムでの検出を容易にするために、電気化学センサーと組み合わせて使用​​できます。

生体分子を標識する様々な方法のうち、蛍光標識は、低濃度でも非常に感度が高く、標的分子の折り畳みや機能を破壊しないという利点がある。^[1]

緑色蛍光タンパク質は、オワンクラゲから自然に発生する蛍光タンパク質で、関心のあるタンパク質の標識として広く使用されています。GFP は、光の吸収によって励起されると、光スペクトルの緑色領域で光子を放出します。発色団は、βバレル内に位置する酸化トリペプチド -Ser^65-Tyr^66-Gly^67 で構成されています。GFP は酸化を触媒し、分子状​​酸素のみを必要とします。GFP は、吸収する光の波長を変更して他の色の蛍光を含めるように改変されています。YFP または黄色蛍光タンパク質、BFP または青色蛍光タンパク質、CFP またはシアン蛍光タンパク質は、GFP バリアントの例です。これらのバリアントは、GFP 遺伝子の遺伝子工学によって生成されます。^[15]

合成蛍光プローブも蛍光ラベルとして使用できます。これらのラベルの利点は、サイズが小さく、色の種類が多いことです。金属キレートペプチドタグなどの化学認識ベースのラベル付けや、酵素反応を利用した生物学的認識ベースのラベル付けなど、さまざまな方法で、目的のタンパク質をより選択的にタグ付けするために使用できます。^[16] ただし、励起波長と発光波長の範囲が広く、安定性が高いにもかかわらず、合成プローブは細胞に有毒である傾向があるため、細胞イメージング研究では通常使用されません。^[1]

蛍光ラベルをmRNAにハイブリダイズさせることで、mRNAの局在などの相互作用や活性を視覚化することができます。蛍光プローブで標識されたアンチセンス鎖を1本のmRNA鎖に結合させ、細胞発達中に観察することで細胞内のmRNAの動きを見ることができます。^[17]

蛍光物質は、それ自体は蛍光を発しないが、特定のタンパク質またはRNA構造に結合すると蛍光を発するリガンド（蛍光リガンド）である。^[18]

例えば、FASTは光活性黄色タンパク質の変異体であり、GFPトリペプチド発色団の化学的模倣物に結合するように設計されている。^[19] 同様に、ほうれん草アプタマーは、GFP発色団の化学的模倣物に結合できる設計されたRNA配列であり、それによって、その配列を含むRNA分子に条件付きで可逆的な蛍光を付与する。^[20]

蛍光標識は非破壊性と高感度で知られており、生体分子の標識と追跡に最も広く使用されている方法の1つとなっています。^[1] 標的の性質に応じて、いくつかの蛍光標識技術を利用できます。

酵素標識では、まず遺伝子と蛍光タンパク質のDNAを使用してDNA構造が形成されます。^[21]転写後、ハイブリッドRNA +蛍光体が形成されます。対象物は、このハイブリッドDNAを認識できる酵素に結合します。通常、蛍光体としてフルオレセインが使用されます。

化学標識または化学タグの使用は、小分子と特定の遺伝子アミノ酸配列との相互作用を利用する。^[22] 化学標識は、GFPの代替として使用されることがある。蛍光プローブとして機能する合成タンパク質はGFPよりも小さいため、より幅広い状況でプローブとして機能することができる。さらに、それらはより幅広い色と光化学的特性を提供する。^[23] 最近の化学標識の進歩により、蛍光タンパク質の特徴的なβバレルの構造的およびサイズ的制限のため、化学タグは蛍光タンパク質よりも好まれるようになった。蛍光タンパク質が変化すると、蛍光特性が失われる。^[22]

タンパク質の標識には短いタグが使用され、タンパク質の折り畳みと機能の破壊を最小限に抑えます。遷移金属は、タグ内の特定の残基をN末端、C末端、またはタンパク質内の内部部位などの部位特異的なターゲットにリンクするために使用されます。タンパク質の標識に使用されるタグの例には、二ヒ素タグ、ヒスチジンタグ、FLAGタグなどがあります。^[1]

蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）は、染色体の長さに沿った染色体部位に特異的なプローブを使用する遺伝子標識技術の一例であり、染色体ペインティングとしても知られています。それぞれ異なる励起および発光波長を持つ複数の蛍光染料がプローブに結合し、その後染色体にハイブリダイズします。蛍光顕微鏡は存在する染料を検出し、それを細胞の核型を明らかにすることができるコンピュータに送信できます。この技術により、欠失や重複などの異常を明らかにすることができます。^[24]

化学タグは蛍光タンパク質よりもイメージング技術に特化しており、これは化学タグが光増感剤を標的タンパク質の近くに局在させることができるためである。^{[25]その後、タンパク質は}超解像顕微鏡、Ca ²⁺イメージング、pHセンシング、過酸化水素検出、発色団支援光不活性化、多光子光学顕微鏡 などのイメージングによって標識および検出することができる。生きた動物における生体内イメージング研究は、Halo-tagとして知られる細菌ハロアルカン脱ハロゲン化酵素由来の単量体タンパク質を使用して初めて実施された。 ^{[22] [26]} Halo-tagはリガンドに共有結合し、可溶性タンパク質のより良い発現を可能にする。^[26]

蛍光染料は放射性プローブと同じ感度を持っていないかもしれませんが、作用中の分子の活動をリアルタイムで示すことができます。^[27]さらに、放射線と適切な取り扱いはもはや懸念事項ではありません。

蛍光タグの開発により、蛍光顕微鏡は固定細胞と生細胞の両方の画像で特定のタンパク質を視覚化できるようになりました。特定のタンパク質の局在は、細胞膜や細胞小器官における異なるタンパク質グループの機能など、細胞生物学における重要な概念につながっています。生細胞イメージングでは、蛍光タグによりタンパク質の動きとそれらの相互作用を監視できます。^[24]

蛍光タグを用いた最近の研究の進歩により、 mRNAの可視化と様々な生物におけるその局在が可能になった。蛍光タグと化学的に結合した合成RNAをマイクロインジェクションで生細胞に導入することで、RNAの生細胞イメージングが可能になる。この技術は、ショウジョウバエの胚におけるオスカーmRNAが卵母細胞の後部領域にどのように局在するかを示すために使用された。^[17]

• 分子タグ速度測定
• 核酸測定用分光光度計
• タンパク質タグ