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| 識別子 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| エイリアス | DHFR、DHFRP1、DYR、ジヒドロ葉酸還元酵素 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 外部ID | OMIM : 126060; MGI : 94890; HomoloGene : 56470; GeneCards : DHFR; OMA :DHFR - オルソログ | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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ジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）は、NADPHを電子供与体として利用してジヒドロ葉酸をテトラヒドロ葉酸に還元する酵素であり、これは一炭素転移化学で使用されるテトラヒドロ葉酸補因子に変換することができる。ヒトでは、DHFR酵素はDHFR遺伝子によってコードされている。[5] [6]これは5番染色体のq14.1領域に存在する。[7]
DHFR には進化的に互いに無関係な 2 つの構造クラスがあります。前者は通常 DHFR と呼ばれ、細菌の染色体と動物に見られます。しかし、細菌では抗生物質の圧力により、このクラスはジアミノヘテロ環式分子の結合パターンが異なり、このクラスの下に多くの「タイプ」が命名されていますが、哺乳類のものは極めて類似しています。[8]後者 (タイプ II) は、プラスチドにコード化された R67 で表され、ホモテトラマーを形成することで機能する小さな酵素です。[9]
関数
| ジヒドロ葉酸還元酵素 | |||||||||
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| 識別子 | |||||||||
| EC番号 | 1.5.1.3 | ||||||||
| CAS番号 | 9002-03-3 | ||||||||
| データベース | |||||||||
| インテンズ | IntEnzビュー | ||||||||
| ブレンダ | BRENDAエントリー | ||||||||
| エクスパス | NiceZyme ビュー | ||||||||
| ケッグ | KEGGエントリー | ||||||||
| メタサイク | 代謝経路 | ||||||||
| プリアモス | プロフィール | ||||||||
| PDB構造 | RCSB PDB PDBe PDBsum | ||||||||
| 遺伝子オントロジー | アミゴー / クイックゴー | ||||||||
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ジヒドロ葉酸還元酵素はジヒドロ葉酸をテトラヒドロ葉酸に変換します。テトラヒドロ葉酸はプリン、チミジル酸、および特定のアミノ酸のデノボ合成に必要なプロトンシャトルです。機能的なジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子は5番染色体にマッピングされていますが、複数のイントロンのない処理された疑似遺伝子またはジヒドロ葉酸還元酵素のような遺伝子が別の染色体上に同定されています。[10]
-
DHFR によって触媒される反応。 -
テトラヒドロ葉酸合成経路。
すべての生物に存在するDHFRは、細胞内のテトラヒドロ葉酸の量を調節する上で重要な役割を果たしています。テトラヒドロ葉酸とその誘導体は、細胞増殖と細胞成長に重要なプリンとチミジル酸の合成に不可欠です。 [11] DHFRは核酸前駆体の合成において中心的な役割を果たしており、DHFRを完全に欠く変異細胞は、成長するためにプリンであるグリシンとチミジンを必要とすることが示されています。[12] DHFRは、ジヒドロビオプテリンからテトラヒドロビオプテリンを回収する酵素としても実証されています。[13]
構造
| ジヒドロ葉酸還元酵素 | |||||||||
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 ニワトリ肝臓ジヒドロ葉酸還元酵素の結晶構造。PDB エントリー8dfr | |||||||||
| 識別子 | |||||||||
| シンボル | DHFR_1 | ||||||||
| パム | PF00186 | ||||||||
| ファム一族 | CL0387 | ||||||||
| インタープロ | 著作権 | ||||||||
| プロサイト | PDOC00072 | ||||||||
| SCOP2 | 1dhi / スコープ / SUPFAM | ||||||||
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DHFRのポリペプチド骨格の折り畳みの主な特徴は、中央の8本鎖のβプリーツシートである。 [14]これらの鎖のうち7本は平行で、8本目は反平行である。4つのαヘリックスが連続するβ鎖を連結する。[15]残基9～24は「Met20」または「ループ1」と呼ばれ、他のループとともに活性部位を囲む主要なサブドメインの一部である。[16]活性部位は配列のN末端側半分に位置し、保存されたPro - Trpジペプチドを含む。トリプトファンは酵素による基質の結合に関与していることが示されている。 [15]
機構
一般的なメカニズム
DHFRはNADPHからジヒドロ葉酸への水素化物の転移を触媒し、プロトン化を伴ってテトラヒドロ葉酸を生成します。[11]最終的に、ジヒドロ葉酸はテトラヒドロ葉酸に還元され、NADPHはNADP+に酸化されます。Met20と活性部位付近の他のループの高い柔軟性は、生成物であるテトラヒドロ葉酸の放出を促進する役割を果たします。特に、Met20ループはNADPHのニコチンアミド環を安定化させ、NADPHからジヒドロ葉酸への水素化物の転移を促進します。[16]
この酵素のメカニズムは段階的かつ定常ランダムである。具体的には、触媒反応はNADPHと基質が酵素の結合部位に結合することから始まり、続いてプロトン化と補因子NADPHから基質への水素化物転移が起こる。しかし、後者の2つのステップは同じ遷移状態で同時に起こることはない。[17] [18]計算と実験のアプローチを用いた研究で、Liuらはプロトン化ステップが水素化物転移に先行すると結論付けている。[19]
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DHFRの酵素機構はpH依存性であることが示されているが、特に水素化物移動段階ではpH変化が活性部位の静電気とその残基のイオン化状態に顕著な影響を及ぼすことが示されている。[19]基質上の標的窒素の酸性度は、水と直接接触しているにもかかわらず疎水性であることが証明されている酵素の結合部位への基質の結合に重要である。[17] [20] Asp27は結合部位で唯一の荷電した親水性残基であり、Asp27の電荷の中和は酵素のpKaを変える可能性がある。Asp27は、基質のプロトン化を助け、水素化物移動に好ましい立体配座で基質を抑制することにより、触媒機構において重要な役割を果たしている。[21] [17] [20]プロトン化段階はエノール互変異性化と関連していることが示されているが、この変換はプロトン供与には好ましくないと考えられている。[18]水分子はプロトン化段階に関与していることが証明されている。[22] [23] [24]水分子の酵素活性部位への進入はMet20ループによって促進される。[25]
DHFRの構造変化
DHFRによって触媒される反応の触媒サイクルには、ホロ酵素（E：NADPH）、ミカエリス複合体（E：NADPH：DHF）、三元生成物複合体（E：NADPH +：THF）、テトラヒドロ葉酸二元複合体（E：THF）、およびTHF、NADPH複合体（E：NADPH：THF）の5つの重要な中間体が組み込まれています。生成物（THF）のE：NADPH：THFからE：NADPHへの解離ステップは、定常状態のターンオーバー中の速度決定ステップです。[21]
DHFRの触媒機構では、立体構造の変化が重要である。[26] DHFRのMet20ループは、活性部位を開いたり、閉じたり、閉塞したりすることができる。[23] [17]それに応じて、開いた状態、閉じた状態、閉塞状態に分類される3つの異なる立体構造がMet20に割り当てられている。さらに、Met20の余分な歪んだ立体構造は、その不明瞭な特性評価結果のために定義された。[23] Met20ループは、ニコチンアミド環が活性部位から閉塞している3つの生成物連結中間体で閉塞した立体構造で観察される。この立体構造の特徴は、NADP +のNADPHによる置換が生成物の解離の前に行われるという事実を説明しています。したがって、次の反応ラウンドは基質の結合時に発生する可能性があります。[21]
R67 DHFR
| R67ジヒドロ葉酸還元酵素 | |||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
 DHF および NADP+ と複合した R67、モノマー。PDB エントリー2rk1。 | |||||||||
| 識別子 | |||||||||
| シンボル | DHFR_2 | ||||||||
| パム | PF06442 | ||||||||
| インタープロ | 著作権 | ||||||||
| SCOP2 | 1vif / スコープ / SUPFAM | ||||||||
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R67 DHFR は、そのユニークな構造と触媒特性のため、広く研究されています。R67 DHFR は、大腸菌染色体 DHFR とは遺伝的または構造的に関連のない、タイプ II R プラスミドでコード化された DHFR です。これは、溶媒にさらされる単一の活性部位孔を持つ 222 対称性を持つホモテトラマーです。[27]この活性部位の対称性により、酵素の異なる結合モードが生まれます。つまり、正の協同性で 2 つのジヒドロ葉酸 (DHF) 分子、負の協同性で 2 つの NADPH 分子、または 1 つの基質と 1 つの基質と結合できますが、後者のみが触媒活性を持ちます。[28]大腸菌染色体 DHFR と比較すると、ジヒドロ葉酸 (DHF) と NADPH の結合における K m が高くなります。触媒速度論がはるかに低いことから、生成物 (THF) の放出ではなく、水素化物移動が速度決定ステップであることが示されています。[29]
R67 DHFR構造では、ホモテトラマーが活性部位の細孔を形成する。触媒プロセスでは、DHFとNADPHが反対の位置から細孔に入る。NADPHのニコチンアミド環とDHFのプテリジン環の間のπ-πスタッキング相互作用は、活性部位の2つの反応物をしっかりと結合する。しかし、結合時にDHFのp-アミノベンゾイルグルタミン酸末端の柔軟性が観察され、遷移状態の形成を促進する可能性がある。[30]
-
大腸菌DHFR（EcDHFR）とR67DHFRの反応速度論の比較 -
EcDHFRとR67 DHFRにおける基質結合の構造の違い
臨床的意義
DHFR変異はジヒドロ葉酸還元酵素欠損症を引き起こします。これはまれな常染色体劣性遺伝性の葉酸代謝異常症で、巨赤芽球性貧血、汎血球減少症、重度の脳葉酸欠乏症を引き起こします。これらの問題は、還元型葉酸（通常は葉酸）を補給することで克服できます。[10] [31] [32]
治療への応用
DHFRはDNA前駆体（チミン）合成において極めて重要な役割を果たすため、阻害薬として魅力的な薬剤ターゲットである。抗生物質のトリメトプリムは細菌のDHFRを阻害し、化学療法剤のメトトレキサートは哺乳類のDHFRを阻害する。しかし、DHFR自体の変異の結果、一部の薬剤に対する耐性が生じている。 [33]
癌
DHFRは細胞内のテトラヒドロ葉酸のレベルに関与しており、DHFRを阻害することで癌や細菌感染の特徴である細胞の成長と増殖を制限することができます。DHFRの競合阻害剤であるメトトレキサートは、DHFRを阻害する抗癌剤の1つです。[34]
葉酸は成長に必要であり[35]、葉酸の代謝経路は癌の治療法開発のターゲットとなっています。DHFRはそのようなターゲットの1つです。フルオロウラシル、ドキソルビシン、メトトレキサートのレジメンは、進行胃癌患者の生存期間を延長することが示されました。[36] DHFR阻害剤のさらなる研究は、癌を治療するためのより多くの方法につながる可能性があります。
感染
細菌も成長し増殖するためにDHFRを必要とするため、細菌DHFRに選択的な阻害剤が抗菌剤として応用されている。[37]トリメトプリムは、さまざまなグラム陽性細菌病原体に対して活性があることが示されている。 [37]しかし、トリメトプリムやDHFRを標的とした他の薬剤に対する耐性は、さまざまなメカニズムにより発生する可能性があり、治療用途の成功を制限している。[38] [39] [40]耐性は、DHFR遺伝子の増幅、DHFRの変異、 [41] [42]薬剤の摂取量の減少などにより発生する可能性がある。いずれにせよ、トリメトプリムとスルファメトキサゾールの併用は、数十年にわたって抗菌剤として使用されている。[37]
一般的に DHFR、特に細菌の DHFR を標的とする他のクラスの化合物は、ジアミノプテリジン、ジアミノトリアジン、ジアミノピロロキナゾリン、スチルベン、カルコン、デオキシベンゾイン、ジアミノキナゾリン、ジアミノピロロキナゾリンなどのクラスに属します。
炭疽菌の治療法の可能性
炭疽菌由来のジヒドロ葉酸還元酵素（BaDHFR）は、感染症である炭疽菌の治療における有効な薬剤ターゲットです。BaDHFR は、大腸菌、黄色ブドウ球菌、肺炎球菌などの他の種のジヒドロ葉酸還元酵素よりも、トリメトプリム類似体に対する感受性が低いです。4 種すべてのジヒドロ葉酸還元酵素の構造アラインメントにより、BaDHFR のみがそれぞれ位置 96 と 102 に フェニルアラニンとチロシンの組み合わせを持っていることがわかります。
BaDHFRのトリメトプリム類似体に対する耐性は、これら2つの残基（F96とY102）によるもので、これにより反応速度と触媒効率も向上します。[44]現在の研究では、BaDHFRの活性部位変異体を使用して、新しい抗葉酸阻害剤のリード最適化を導きます。[44]
研究ツールとして
DHFRは、分割タンパク質アプローチを用いたタンパク質断片補完アッセイ（PCA）において、タンパク質間相互作用を検出するためのツールとして使用されてきました。 [45]
DHFRを欠くCHO細胞は、組み換えタンパク質の生産に最も一般的に使用される細胞株です。これらの細胞は、単一の発現システムでdhfr遺伝子と組み換えタンパク質の遺伝子を含むプラスミドでトランスフェクトされ、その後、チミジンを欠く培地で選択条件にさらされます。目的の遺伝子とともに外因性DHFR遺伝子を持つ細胞のみが生き残ります。この培地にDHFRの競合阻害剤であるメトトレキサートを補充すると、DHFRを最も多く発現する細胞をさらに選択することができ、その結果、最高の組み換えタンパク質生産者を選択することができます。[46]
インタラクション
ジヒドロ葉酸還元酵素はGroEL [47]およびMdm2 [48]と相互作用することが示されている。
インタラクティブな経路マップ
下記の遺伝子、タンパク質、代謝物をクリックすると、それぞれの記事にリンクします。[§ 1]
- ^ インタラクティブなパスウェイマップは、WikiPathways: "FluoropyrimidineActivity_WP1601" で編集できます。
参考文献
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