タンパク質生産

タンパク質生産は、特定のタンパク質を生成するバイオテクノロジーのプロセスです。これは通常、生物における遺伝子発現を操作して、大量の組み換え遺伝子を発現させることによって達成されます。これには、組み換え DNAのメッセンジャーRNA ( mRNA )への転写、mRNA のポリペプチド鎖への翻訳が含まれ、最終的に機能性タンパク質に折り畳まれ、特定の細胞内または細胞外の場所に標的化される場合があります。^[1]

タンパク質生産システム（発現システムとも呼ばれる）は、生命科学、バイオテクノロジー、医学で使用されています。分子生物学研究では、多くのタンパク質と酵素が使用されていますが、その多くは発現システム由来です。特に、PCR用のDNA ポリメラーゼ、RNA 分析用の逆転写酵素、クローニング用の制限エンドヌクレアーゼ、および創薬において生物学的標的として、または潜在的な薬剤自体としてスクリーニングされるタンパク質を作成するために使用されます。また、工業発酵、特に糖尿病の治療のためのヒトインスリンなどのバイオ医薬品の製造や酵素の製造において、発現システムは重要な用途があります。

一般的に使用されているタンパク質生産システムには、細菌^{[2] [3]} 酵母^{[4] [5]} バキュロウイルス/昆虫^[6] 哺乳類細胞[ ^{7] [8]および最近では}Myceliophthora thermophilaなどの糸状菌に由来するものが含まれます。^[9]バイオ医薬品がこれらのシステムのいずれかで製造されると、宿主細胞タンパク質と呼ばれるプロセス関連の不純物も最終製品に微量に含まれます。^[10]

最も古く、最も広く使用されている発現システムは細胞ベースであり、「発現ベクター、そのクローンDNA、およびベクターの宿主の組み合わせであり、宿主細胞内で外来遺伝子の機能を可能にするコンテキストを提供し、つまり高レベルでタンパク質を生成する」と定義できます。^{[11] [12]}過剰発現は、顕著な遺伝子関連表現型を生成する異常かつ過剰なレベルの遺伝子発現です。^{[13] [14] [説明が必要]}

発現のために外来DNA を細胞に導入する方法は多数あり、発現には多くの異なる宿主細胞が使用される可能性があり、各発現システムには明確な利点と欠点があります。発現システムは通常、宿主と DNA ソースまたは遺伝物質の送達メカニズムによって参照されます。たとえば、一般的な宿主は、細菌(大腸菌、枯草菌など)、酵母( S. cerevisiae ^[5]など)、または真核細胞株です。一般的な DNA ソースと送達メカニズムは、ウイルス(バキュロウイルス、レトロウイルス、アデノウイルスなど)、プラスミド、人工染色体、バクテリオファージ(ラムダなど) です。最適な発現システムは関与する遺伝子によって異なり、たとえば、大幅な翻訳後修飾を必要とするタンパク質にはSaccharomyces cerevisiaeが好まれることがよくあります。mRNAのヒトのようなスプライシングが必要な場合は、昆虫または哺乳類の細胞株が使用されます。それにもかかわらず、細菌発現には、構造決定のためのX線結晶構造解析や核磁気共鳴実験 に必要な大量のタンパク質を容易に生成できるという利点があります。

細菌は原核生物であるため、必要な翻訳後修飾や分子の折り畳みを行うための完全な酵素機構を備えていません。そのため、細菌で発現する多ドメイン真核生物タンパク質は機能しないことがよくあります。また、多くのタンパク質は封入体として不溶性になり、強力な変性剤とそれに続く面倒なタンパク質の折り畳みなしでは回復が困難です。

これらの懸念に対処するため、タンパク質を真核生物と同等かそれに近いものにする必要がある用途向けに、複数の真核細胞を使用する発現システムが開発されました。植物 (タバコなど)、昆虫、または哺乳類 (ウシなど) の細胞に遺伝子を導入し、懸濁液で培養し、組織または生物全体として培養して、完全に折り畳まれたタンパク質を生成します。しかし、哺乳類の生体内発現システムには、収量が低いなどの制限があります (時間がかかる、宿主細胞に対する毒性など)。細菌や酵母の高い収量/生産性とスケーラブルなタンパク質特性と、植物、昆虫、および哺乳類システムの高度なエピジェネティック特性を組み合わせるために、単細胞真核生物 (非病原性の「リーシュマニア」細胞) を使用する他のタンパク質生産システムが開発されています。

大腸菌は最も広く使用されている発現宿主の1つであり、DNAは通常プラスミド発現ベクターに導入されます。大腸菌での過剰発現技術は十分に開発されており、遺伝子のコピー数を増やすかプロモーター領域の結合強度を高めて転写を助けることで機能します。 ^[3]

例えば、目的のタンパク質のDNA配列を、lac（多くの場合LacUV5 ）プロモーターを含む高コピー数プラスミドにクローニングまたはサブクローニングし、それを大腸菌に形質転換する。IPTG（ラクトース類似体）を加えるとlacプロモーターが活性化され、細菌が目的のタンパク質を発現するようになる。^[2]

大腸菌BL21株とBL21(DE3)株は、タンパク質生産によく使用される2つの株です。B系統のメンバーであるため、lonおよびOmpTプロテアーゼが欠如しており、生産されたタンパク質が分解されるのを防ぎます。BL21(DE3)に含まれるDE3プロファージは、T7 RNAポリメラーゼ（LacUV5プロモーターによって駆動）を提供し、代わりにT7プロモーターを持つベクターを使用できるようにします。^[15]

グラム陽性コリネバクテリウムの非病原性種は、さまざまなアミノ酸の商業生産に使用されています。C . glutamicum種は、人間の食品、動物飼料、医薬品の成分である グルタミン酸とリジン^[16]の生産に広く使用されています。

機能的に活性なヒト上皮成長因子の発現はC. glutamicumで行われており^[17]、ヒトタンパク質の工業規模生産の可能性を示しています。発現されたタンパク質は、一般的な分泌経路（Sec）またはツインアルギニン転座経路（Tat）のいずれかを介して分泌される可能性があります。^[18]

グラム陰性細菌とは異なり、グラム陽性コリネバクテリウムには、ヒトの抗原性エンドトキシンとして機能するリポ多糖類が欠けている。^[要出典]

非病原性グラム陰性細菌であるシュードモナス・フルオレッセンスは、組み換えタンパク質の高レベル生産に使用され、一般的にはバイオ医薬品やワクチンの開発に使用されています。P. fluorescensは代謝的に多用途な生物であり、高スループットスクリーニングと複合タンパク質の迅速な開発を可能にします。P. fluorescens は、活性で可溶性のタンパク質を迅速かつ確実に高力価で生産する能力で最もよく知られています。^[19]

S. cerevisiaeまたはPichia pastorisのいずれかを使用した発現システムは、化学的に定義されたタンパク質培地で、哺乳類細胞と同様に処理されるタンパク質を高収率で安定して持続的に生産することを可能にする。^{[4] [5]}

糸状菌、特にアスペルギルスとトリコデルマは、自身のゲノム（「天然」、「相同」）および組み換えDNA（「異種」）から多様な工業用酵素を生産するために長い間使用されてきました。 ^[9]

最近では、Myceliophthora thermophila C1 が、天然および異種タンパク質のスクリーニングと生産のための発現プラットフォームとして開発されました。発現システム C1 は、液中培養で低粘度形態を示し、複雑な増殖および生産培地の使用を可能にします。また、C1 は、アスペルギルスやトリコデルマが行う傾向があるように、異種タンパク質を「過剰にグリコシル化」しません。^[9]

バキュロウイルスに感染した昆虫細胞^[20] ( Sf9、Sf21、High Five株) または哺乳類細胞^[21] ( HeLa、HEK 293 ) は、真菌や細菌のシステムでは生産できない糖化タンパク質や膜タンパク質の生産を可能にします。^{[20] [6]}大量のタンパク質を生産するのに役立ちます。 感染した宿主細胞は感染サイクルごとに最終的に溶解して死滅するため、遺伝子は継続的に発現されません。^[22]

非溶解性昆虫細胞発現は、溶解性バキュロウイルス発現システムの代替手段です。非溶解性発現では、ベクターは、その後の遺伝子発現のために昆虫細胞の染色体DNAに一時的または安定的にトランスフェクトされます。 ^{[23] [24]}これに続いて、組み換えクローンの選択とスクリーニングが行われます。^[25]非溶解性システムは、バキュロウイルス感染細胞発現と比較して、より高いタンパク質収量とより迅速な組み換え遺伝子の発現を得るために使用されています。^[24]このシステムに使用される細胞株には、Spodoptera frugiperda細胞からのSf9、Sf21 、 Trichoplusia ni細胞からのHi-5、およびDrosophila melanogaster細胞からのSchneider 2細胞とSchneider 3細胞があります。^{[23] [25]}このシステムでは、細胞は溶解せず、いくつかの培養モードを使用できます。^[23]さらに、タンパク質生産の実行は再現可能です。^{[23] [24]}このシステムは均質な製品を生み出す。^[24]このシステムの欠点は、生存可能なクローンを選択するために追加のスクリーニングステップが必要になることである。^[25]

Leishmania tarentolae（哺乳類には感染しない）発現システムでは、化学的に定義された培地で高収率のタンパク質を安定して持続的に生産できます。生産されたタンパク質は、グリコシル化やジスルフィド結合形成など、完全に真核生物的な翻訳後修飾を受けます。 ^[要出典]

最も一般的な哺乳類発現システムはチャイニーズハムスター 卵巣（CHO）細胞とヒト胎児腎臓（HEK）細胞である。^{[26] [27] [28]}

• チャイニーズハムスター卵巣細胞^[27]
• マウス骨髄腫リンパ芽球様細胞（NS0細胞など）^[26]
• 完全に人間
  • ヒト胎児腎細胞（HEK-293）^[27]
  • ヒト胎児網膜細胞（クルセルPer.C6）^[27]
  • ヒト羊膜細胞（グリコトープおよびCEVEC）^[要出典]

タンパク質の無細胞生産は、精製されたRNAポリメラーゼ、リボソーム、tRNA、リボヌクレオチドを使用してin vitroで行われます。これらの試薬は、細胞からの抽出または細胞ベースの発現システムから生成できます。無細胞システムの発現レベルが低く、コストが高いため、細胞ベースのシステムの方が広く使用されています。^[29]

• Cellosaurus、細胞株のデータベース
• 遺伝子発現
• 単細胞タンパク質
• タンパク質精製
• 精密発酵
• 宿主細胞タンパク質
• 組み換えタンパク質のリスト

• Higgins SJ、Hames BD (1999)。タンパク質発現：実践的アプローチ。オックスフォード大学出版局。ISBN 978-0-19-963623-5。
• Baneyx, François (2004)。タンパク質発現技術：現状と将来の動向。Garland Science。ISBN 978-0-9545232-5-1。