光活性化局在顕微鏡法

光活性化局在顕微鏡法（PALMまたはFPALM）^{[1] [2]} および確率的光学再構成顕微鏡法（STORM）^[3]は、回折限界を超える解像度の画像を取得できる広視野（レーザー走査共焦点顕微鏡などの点走査技術とは対照的）蛍光顕微鏡画像化法である。これらの方法は、光学超解像顕微鏡法の一般的な出現を受けて2006年に提案され、Nature Methods誌で2008年のMethods of the Yearとして取り上げられた。^{[4]標的生物物理学的画像化法としてのPALMの開発は、主に新種の発見と、光活性化}GFPなどの制御可能なフォトクロミズム を示す蛍光タンパク質の変異体の工学的操作によって促進された。しかし、同じ基本原理を共有するSTORMの同時開発は、もともと対になったシアニン色素を使用していた。ペアの一方の分子（活性剤と呼ばれる）は、吸収極大付近で励起されると、もう一方の分子（レポーターと呼ばれる）を蛍光状態に再活性化する働きをします。

PALM、STORM、および関連技術には、有機蛍光体と蛍光タンパク質の両方を含む、ますます多くの染料が使用されています。生細胞イメージングと互換性のある染料もあれば、より高速な取得や高密度の標識を可能にする染料もあります。特定の蛍光体の選択は、最終的にはアプリケーションとその基礎となる光物理的特性に依存します。^[5]

どちらの技術も大きな技術的進歩を遂げており、^[6]特に多色イメージングと3次元への拡張が可能になっており、現在、サンプルからの蛍光を収集する2つの反対の対物レンズを使用した干渉法によって得られた3次元での最高の軸方向分解能は10nmである。^[7]

従来の蛍光顕微鏡検査は、免疫組織化学のように抗体に結合した蛍光分子、または対象の遺伝子に遺伝的に融合した蛍光タンパク質を使用してサンプルを選択的に染色することによって行われます。通常、蛍光体が濃縮されるほど、蛍光画像のコントラストは向上します。

単一の蛍光体は、放出される光子の数が十分に多く、対照的に背景が十分に低い場合、顕微鏡（または肉眼^[8]）で視覚化できます。顕微鏡で観察される点光源の2次元画像は、イメージングシステムのエアリーディスク（点像分布関数の一部）に対応する拡張されたスポットです。2つの近接した蛍光体を2つの個別の実体として識別する能力は、光の回折によって制限されます。これは、2つの点光源を分離できる最小距離が次のように与えられる と述べるアッベの基準によって定量化されます。${\displaystyle d}$

${\displaystyle d={\frac {\lambda }{2NA}}}$

ここで、は蛍光発光の波長、NA は顕微鏡の開口数です。実用的な最短励起波長での理論的な解像度の限界は、横方向では約 150 nm、軸方向では 400 nm に近づきます (開口数が 1.40 で励起波長が 400 nm の対物レンズを使用した場合)。 ${\displaystyle \lambda}$

しかし、隣接する2つの蛍光分子からの発光を区別できれば、つまり2つそれぞれから発せられる光子を識別できれば、回折限界を克服することができます。^[9]特定の分子からの光子セットが収集されると、顕微鏡の像面に回折限界スポットが形成されます。このスポットの中心は、観測された発光プロファイルを既知の幾何学的関数、通常は2次元のガウス関数にフィッティングすることで見つけることができます。点発光体の中心を特定する際に生じる誤差は、放出された光子数の逆平方根として第一近似値に比例し、十分な光子が収集されれば、元の点広がり関数よりもはるかに小さい位置特定誤差を簡単に得ることができます。

多数の蛍光分子が存在する密集した環境内で個々の蛍光分子を識別し、位置を特定するという 2 つのステップが、PALM、STORM、およびそれらの開発の基礎となっています。

分子識別には多くのアプローチがありますが、選択された蛍光体の光誘起フォトクロミズムは、蛍光発光を時間的に分離することで隣接する分子を区別する最も有望なアプローチとして開発されました。確率的にまばらな蛍光体のサブセットを特定波長の光でオンにすることで、個々の分子を励起し、そのスペクトルに従って画像化することができます。サンプル内に活性蛍光体が蓄積すると、最終的に回折限界画像に戻ってしまいますが、これを避けるために、PALM では自発的に発生する光退色現象を利用し、STORM では染料の蛍光オン状態と暗いオフ状態間の可逆的な切り替えを利用します。

要約すると、PALM と STORM は、蛍光顕微鏡で、それぞれが少数の活性な孤立した蛍光体を含む多数の画像を収集することに基づいています。画像化シーケンスでは、各蛍光体を非発光 (または低発光) 状態から明るい状態へ、そして再び非発光または退色状態へ確率的に活性化するために必要な多数の発光サイクルが考慮されています。各サイクル中、活性化された分子の密度は十分に低く保たれ、個々の蛍光体の分子画像は通常は重なり合いません。

シーケンスの各画像では、蛍光体の位置が、通常は回折限界を超える精度（通常、数 nm から数十 nm の範囲）で計算され、その結果得られたすべての局在分子の中心の位置の情報を使用して、超解像度の PALM または STORM 画像が作成されます。

ローカリゼーションの精度は次の式に従って計算できます。 ${\displaystyle \sigma}$

${\displaystyle \sigma ={\sqrt {\left({\frac {s_{i}^{2}+{\frac {a^{2}}{12}}}{N}}\right)\cdot \left({\frac {16}{9}}+{\frac {8\pi s_{i}^{2}b^{2}}{a^{2}N^{2}}}\right)}}}$

ここで、Nは収集された光子の数、aはイメージング検出器のピクセルサイズ、平均背景信号、 点広がり関数の標準偏差です。^[10] 複数の蛍光体を広い領域に同時に局在させる必要があるため、これらの方法は広視野であり、検出器としてCCD、EMCCD、またはCMOSカメラを使用します。 ${\displaystyle b^{2}}$${\displaystyle s_{i}}$

位置特定精度を最大化するために信号対雑音比を向上させる必要があるため、このコンセプトは、全反射蛍光顕微鏡(TIRF) や光シート蛍光顕微鏡などの光学セクショニングを可能にする広視野蛍光顕微鏡と頻繁に組み合わせられます。

最終画像の解像度は、回折ではなく、各局在の精度と局在の数によって制限されます。したがって、超解像度画像は、すべての局在分子の座標の点描画表現です。超解像度画像は通常、画像平面内の各分子を、収集された光子の数に比例する振幅と、局在精度に依存する標準偏差を持つ 2 次元ガウス分布として表すことによってレンダリングされます。

PALM/STORM 超解像イメージングで使用される蛍光体の特異な光物理的特性は、多色イメージングに制約と機会の両方をもたらします。これまでに 3 つの戦略が浮上しています。発光ビームスプリッターを使用したスペクトル分離された蛍光体の励起、^[12] 、 STORM モードでの複数のアクティベーター/レポーターの使用^{[13] [14]}、スペクトル的に近い蛍光体の比率測定イメージング^{[15] です。}

PALM と STORM はもともと 2D (x,y) イメージング法として開発されましたが、急速に 3D (x,y,z) 対応技術へと発展しました。サンプル内の単一の蛍光体の軸方向の位置を決定するために、現在、以下の方法が使用されています。2D (x,y) 画像に z 依存の特徴を導入するための点像分布関数の修正 (最も一般的な方法は、PSF に非点収差を導入することです) 、同じ PSF の 2 つの画像を一方から他方に対して焦点をずらして比較することで軸方向の位置を決定するマルチプレーン検出、 2 つの対向する対物レンズと複数の検出器を使用したエミッターの軸方向の位置の干渉測定による決定、 ^[7]時間的焦点合わせを使用して励起/活性化を制限する、光シート励起/活性化を使用してサンプル内の z 平面に沿って任意に配置された数百ナノメートルの厚さの層に制限する。

活性化、励起、および不活性化/漂白の複数サイクルの必要性は、通常、PALM/STORM 画像の形成に長時間かかることを意味し、したがって固定サンプルに対する操作となります。2007 年には早くも PALM/STORM を生きた細胞に対して行った多数の研究が発表されています^[16]。これらの技術を使用してライブ超解像イメージングを実行できるかどうかは、最終的には、非常に短時間で単一のエミッターから十分な光子を収集するという技術的な制限に依存します。これは、プローブの光物理的制限と、使用する検出器の感度の両方に依存します。焦点接着の組織化の変更などの比較的遅い (数秒から数十秒) プロセスはPALMによって調査されてきましたが^[17] 、 STORM は、クラスリン被覆ピットの膜拡散やミトコンドリアの分裂/融合プロセスなどのより高速なプロセスのイメージングを可能にしました。生細胞PALMの有望な応用としては、光活性化を利用して高密度単一粒子追跡（sptPALM ^{[18] ）を行うことがあり、これは}単一粒子追跡の従来の限界を克服し、非常に低濃度の蛍光体を表示するシステムで動作することを可能にする。

従来の PALM および STORM 測定はサンプルの物理的構造を決定するために使用され、蛍光イベントの強度によって位置の確実性が決定されますが、これらの強度を使用して、蛍光体とナノフォトニック構造の相互作用をマッピングすることもできます。これは、金ナノロッドなどの金属 (プラズモニック) 構造^{[19] [20]} とシリコンナノワイヤなどの半導体構造の両方で実行されています。^[21] これらのアプローチは、対象サンプルの表面で機能化された蛍光体 (ここで言及したプラズモニック粒子研究の場合) に使用することも、サンプルの周囲の基板にランダムに吸着させて使用することもできます。これにより、構造に対するすべての位置で蛍光体とナノ構造の相互作用の完全な 2D マッピングが可能になります。^[21]

これらの研究では、点像分布関数のフィッティングによる標準的な位置特定不確かさに加えて、ナノ粒子によって散乱された光との自己干渉によって、画像化された点像分布関数に歪みや変位が生じ、^{[20] [21]}測定の解析が複雑になることが判明している。ただし、測定システムに許容される光の角度分布を制御するメタサーフェスマスクを組み込むなどして、これらを制限することは可能かもしれない。^[22]

PALM と STORM は共通の基本原理を共有しており、数多くの開発により、この 2 つの技術はさらに絡み合う傾向にあります。それでも、いくつかの技術的な詳細と基本的な点で異なります。技術的な面では、PALM は、光活性化蛍光タンパク質への遺伝子融合構造の形で外因的に発現された蛍光体を使用して、生物学的標本に対して実行されます。一方、STORM は、有機蛍光体でタグ付けされた抗体を使用して、サンプル内の内因性分子の免疫標識を使用します。どちらの場合も、蛍光体は光によってアクティブ ON 状態と非アクティブ OFF 状態の間で駆動されます。ただし、PALM では、光活性化と光退色によって蛍光体の寿命が限られた時間間隔に制限されるため、その間は蛍光が断続することなく蛍光体が連続的に発光することが望ましいです。STORM では、有機蛍光体 (通常は蛍光タンパク質よりも明るい) の確率的な光点滅が、もともと隣接する染料を分離するために利用されていました。この点で、点滅が強力であればあるほど、隣接する 2 つの蛍光体を区別できる可能性が高くなります。

この点に関して、いくつかの研究では、活性化された蛍光体を数えることによってサンプル中に存在する蛍光体（したがって、目的のタンパク質）の数を定量化するPALMの可能性を検討してきました。^{[11] [23] [24]}実験で使用される蛍光ラベルの蛍光ダイナミクスを処理するために使用されるアプローチによって、超解像画像の最終的な外観と、サンプル内の局在イベントとタンパク質との間の明確な対応を決定できる可能性が決まります。

• 固定化された蛍光タンパク質が光活性化され、励起され、漂白される
• 低親和性光変換アクチンを用いた樹状突起棘の超解像動態イメージング^[25]
• 超解像光学顕微鏡を用いたラット海馬ニューロンのサブスパインアクチンの動態の調査^[26]

• 顕微鏡とデジタルイメージングの Zeiss 教育ページ内の超解像顕微鏡
• 顕微鏡教育のためのニコン教育リソースにおける超解像の基本概念
• Eric Betzig と Harald Hess の講演: PALM 顕微鏡の開発
• Xiaowei Zhuang の講演: 超解像顕微鏡 2015-03-24 にWayback Machineでアーカイブ
• 光学顕微鏡：進行中の現代革命（入門レビュー）