異種発現

遺伝子同定は、異種スクリーニング技術として知られるコンピュータベースの方法を使用して行うことができます。^{[ 2 ]} cDNA配列のデジタルライブラリには、多くのシーケンスプロジェクトからのデータが含まれており、既知の遺伝子の配列情報に簡単にアクセスできます。

ゲノム配列が不明または入手できない場合、DNA はランダムな断片化、クローニング、スクリーニングのプロセスを経て表現型を決定します。^{[ 3 ]}特定の遺伝子を取得するためにさまざまな方法を使用できますが、未知の DNA 配列の構成要素を明らかにする最も簡単な方法は、まずその制限酵素を特定することです。制限酵素は、制限部位として知られる分子内の特定の場所で DNA を断片に切断する酵素です。これらの酵素は細菌または古細菌に存在し、ウイルスの侵入から DNA を保護することが知られています。制限酵素はそれぞれ異なり、それぞれが DNA 内の特定の塩基対配列のみを認識し、その多くは回文構造になる傾向があります。各酵素の位置を特定することにより、制限酵素に関連する配列を特定して分離することができます。

配列が既知であれば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）と呼ばれる技術を用いて目的の遺伝子を単離することができる。PCRの目的は、特定のDNA断片を同定するだけでなく、変性、アニーリング、伸長の各段階を経て増幅することである。変性では、二本鎖DNAテンプレートを95  ℃の高温条件下に置き、弱い水素結合を切断して鎖分離を強制する。アニーリングでは、反応を冷却して水素結合を再形成させ、プライマーが一本鎖DNAテンプレート上の相補配列に結合することを促進する。最後に、伸長段階では、DNAポリメラーゼがプライマーの付いた一本鎖DNAを認識し、複製に必要な特定の配列を単離する。^{[ 3 ]}

大腸菌は、その急速な増殖速度（約20～30分）、連続発酵能力、および比較的低コストであることから、広く利用されているシステムです。 ^{[ 9 ]} さらに、酵母は異種タンパク質を高い相対量で発現する能力があります。具体的には、酵母で生産されるタンパク質の最大30%が異種遺伝子産物である可能性があります。また、生産規模を拡大するために、安全な大腸菌株が開発されています。大腸菌の魅力的な宿主特性に加えて、研究者が完全なゲノム配列を含む遺伝学に関する膨大な知識を持っているため、この宿主は非常に人気があります。しかし、目的遺伝子の配列に起因する問題と、宿主としての大腸菌の限界に起因する問題が生じます。たとえば、大腸菌で大量に発現されたタンパク質は沈殿および凝集する傾向があり、そのため、別の変性、再変性回復方法が必要になります。最後に、大腸菌は、挿入される遺伝子に依存する特定の条件下でのみ最適に機能します。

枯草菌（Bacillus subtilis、B. subtilis）はグラム陽性で非病原性の微生物であり、リポ多糖（LPS）を産生しません。グラム陰性菌に見られるLPSは、ヒトや動物に多くの変性疾患を引き起こすことが知られており、大腸菌のタンパク質産生にも影響を与えます。そのため、潜在的に安全であると考えられていますが、 B. subtilisはFDAによって一般的に安全とみなされる（GRAS）ものとして正式に分類されていません。B . subtilisは、バクテリオファージやプラスミドによって容易に形質転換される遺伝的特性を持っています。 ^{[ 11 ]}さらに、培養培地への直接分泌によってより多くの精製ステップを容易にすることができ、これらのタンパク質を非特異的に分泌する能力があるため、スケールアップも容易です。現在までに、B. subtilisは、代謝、遺伝子制御、分化、タンパク質発現、生物活性物質の生成など、さまざまな生物学的メカニズムの研究に成功裏に使用されてきました。また、ゲノム情報が広く利用可能であることから、世界で最もよく研​​究されているグラム陽性菌でもあります。この宿主システムの欠点としては、目的タンパク質の発現が減少または全くないこと、および異種タンパク質を標的とする分解性細胞外プロテアーゼが産生されることが挙げられます。最終的に、枯草菌の魅力的な特性にもかかわらず、これらの制限により、枯草菌よりも大腸菌がデフォルトの宿主システムとなっています。しかし、さらなる研究と最適化により、枯草菌は膜タンパク質を大規模に生産する可能性を秘めています。 ^{[ 12 ]}

真核細胞は、治療目的で使用されるタンパク質の原核細胞発現の代替として使用できます。酵母は、原核システムと同様に、高い発現レベル、速い成長、および安価な維持を使用する単細胞真菌です。酵母は食品生物であるため、毒素を含む可能性のある大腸菌とは異なり、医薬品の製造にも適しています。酵母はまた、単純な培地で90分で倍加する比較的速い成長速度を持ち、操作も容易です。大腸菌と同様に、酵母も完全なゲノム配列が利用可能です。最も一般的に使用される酵母はS. cerevisiaeで、タンパク質処理やタンパク質フォールディングなどの翻訳後修飾を実行できます。S . cerevisiae、P. pastorisは、急速に成長し、高度に適応する単純な真核生物です。^{[ 13 ]}真核システムはヒトへの応用があり、 B型肝炎およびハンタウイルスのワクチンを製造しました。組換え技術や完全な生物活性の合成において、哺乳類細胞の利用は着実に増加している。このシステムはタンパク質を分泌し、糖鎖修飾を行うとともに、適切なタンパク質フォールディングと翻訳後修飾を導入する。しかし、糖鎖修飾能力を高めると、マンノースの過剰付加、すなわちマンノースの大量付加がしばしば観察される。これは適切なタンパク質フォールディングを阻害する。酵母は細菌細胞と哺乳類細胞の中間的な性質を持ち、依然として広く利用されている宿主システムである。酵母を発現系として用いる場合、増殖速度が遅く、高価な栄養素を必要とするため、生産コストが高くなる。

バキュロウイルスは昆虫に感染するウイルスであり、昆虫という真核生物における異種発現のシステムとして登場しました。真核生物として、タンパク質の修飾、処理、真核生物輸送システムなど、酵母や細菌システムにはないいくつかの重要な機能を持っています。非常に高い濃度で増殖できるため、大量の組換えタンパク質を得るプロセスが簡素化されます。さらに、研究者らは、発現したタンパク質は通常それぞれの区画に局在し、容易に回収できることを発見しました。これらのゲノムは、原核生物システムと比較して非常に大きく、より大きな断片を取り込むことができ、脊椎動物や哺乳類細胞には感染しません。しかし、これらのバキュロウイルスベクターには制限があります。これらのウイルスは本来無脊椎動物に感染するため、脊椎動物のタンパク質処理に違いがあり、有害な修飾を引き起こす可能性があります。^{[ 14 ]}

アフリカツメガエル（Xenopus laevis）の未受精卵母細胞も、異種発現の発現系として利用されてきた。^{[ 15 ]} 1982年にアセチルコリン受容体の発現に初めて用いられて以来、様々な目的で利用されてきた。これらの卵母細胞はカエルによって一年中産生されるため比較的豊富であり、翻訳は高い忠実度で行われる。卵母細胞系には多くの制約があるが、その中でも大きな制約の一つは、産生された異種タンパク質がカエルの卵母細胞のタンパク質と相互作用し、哺乳類細胞の場合とは異なる挙動を示すことである。さらに、哺乳類は二倍体であるのに対し、アフリカツメガエルは各染色体の相同コピーを4つ持っているため、由来するタンパク質は異なる機能を持つ可能性がある。アフリカツメガエル系でのタンパク質産生を調べるには、さらなる研究が必要である。

哺乳類細胞は培養がより困難で、時間がかかり、より多くの栄養素を必要とし、コストもかなり高くなりますが、翻訳後修飾を必要とするタンパク質は、製品の臨床的有効性と忠実性を保護するために、哺乳類細胞で発現させる必要があります。しかし、哺乳類細胞間でも違いが見られ、例えば、げっ歯類細胞とヒト細胞ではグリコシル化に違いがあります。同じ細胞株内でも、細胞株を安定化させるとグリコシル化パターンが変化することがよくあります。哺乳類細胞を宿主システムとして使用する唯一の商業的に実行可能な方法は、高付加価値の最終製品です。一般的な哺乳類細胞株、特に研究で使用されているものには、Cercopithecus aethiops サル由来の COS-7、Cricetulus griseus ハムスター由来の CHO、および HEK293 ヒト腎臓細胞株などがあります。^{[ 3 ]}

一般的な原生生物の真核発現系は粘菌のDictyostelium discoideumであり、クロマチンと同様にパッケージ化された環状プラスミドを持つという点で独特である。^{[ 16 ]}単純な真核半数体生物であるため、哺乳類細胞培養の高価な条件なしに高濃度で増殖でき、翻訳後修飾を行うことができる。タンパク質自体は、膜結合型、分泌型、細胞結合型など、いくつかの形態で発現し、タンパク質産物を糖鎖修飾することができる。

菌類は多くの生態系の自然分解者です。そのため、細菌系よりも多くの酵素を分泌することができます。しかし、菌類を発現系として利用するには、特に菌類の遺伝学に関する知識が不足しているため、いくつかの障壁があります。特に糸状菌は注目されている宿主系であり、ペニシリウム（ペニシリンの由来）、トリコデルマ・リーセイ、 アスペルギルス・ニガーなどが含まれます。糸状菌は細胞外タンパク質を効率的に生産し、タンパク質抽出のための細胞破壊という追加のステップを省略できます。また、一部の菌類は安価な生育条件と培地条件を備えています。さらに、菌類は真核生物タンパク質に役立つ解糖と修飾能力も持っています。加えて、ワクチン関連タンパク質の生産にも成功しており、一部の糸状菌はFDAによってGRASと認定されています。しかし、この宿主系を使用する主な欠点は、収量が極めて低く、経済的に成り立たないことです。さらに、生成されるタンパク質の量が少ないため、真菌プロテアーゼによって分解されることが多い。これに対処するためのアプローチとして、プロテアーゼ欠損株の使用が行われている。研究者たちはまた、さまざまな遺伝子破壊法も試みている。真菌の遺伝子制御と発現についてより深く理解することで、糸状菌が有望な宿主システムとなることが期待できる。^{[ 16 ]}

研究者は、タンパク質の相互作用を研究するために異種発現技術をよく使用します。たとえば、細菌は、NifEN を介して窒素固定酵素の異種発現と生合成において最適化されています。これは、大腸菌で発現および改変することができます。^{[ 17 ]} この宿主では、サブユニット、金属クラスター、および機能の完全なセットを備えた NifEN のような複雑なヘテロマルチマー金属タンパク質を異種発現することは依然として非常に困難です。この細菌宿主で改変された NifEN 変異体は、類似の補因子結合部位で補因子の有効性を維持できるため、異種発現の証拠となり、この金属酵素の今後の研究を促進します。さらに、工業用タンパク質の生産における新しい糸状菌システムの有用性に関する最近の報告があります。利点には、高い形質転換頻度、中性 pH でのタンパク質生産、非糸状形態の菌株選択による発酵液の低粘度、および短い発酵時間などがあります。アルブミン、IgG、インターロイキン6などの多くのヒト遺伝子産物は、異種発現系でさまざまな程度の成功度で発現されている。^{[ 18 ]}一貫性のない結果は、遺伝子ごとの研究から翻訳後修飾に対する全生物アプローチへの移行を示唆している。卵母細胞は、その大きなサイズと翻訳能力に容易に最適化されており、統合された細胞応答を観察することができる。これは、単一細胞内の単一分子の研究から中スループットの薬剤スクリーニングアプリケーションに適用される。注入されたcDNAの発現について卵母細胞をスクリーニングすることにより、異種発現のモデルとしてのマイクロインジェクションの応用は、細胞シグナル伝達、輸送、構造、およびタンパク質機能の観点からさらに研究することができる。^{[ 15 ]}

異種発現系は、in vitroでの薬物開発において、再現性の高い条件下で酵素活性を評価するために臨床的に組み込むことができる。^{[ 19 ] [ 13 ]}これは、侵襲性の高い処置や薬物有害反応の発生の可能性の代替として機能し、患者のリスクを最小限に抑えるのに役立つ。酵素活性分析には、酵素変異体を分類するためのさまざまな発現系が必要である。他の動物とは異なり、哺乳類細胞では薬物代謝に関与する酵素の発現レベルが低いため、機能的な組換えタンパク質の発現は特にコストのかかるプロセスである。その結果、翻訳後修飾プロセスは種によって異なり、正確な比較が制限される。市場にリリースされた最初の異種タンパク質製品は、ヒトインスリンであり、最も一般的にはヒューマリンとして知られている。この製品は、大腸菌株を使用して作られた。大腸菌を含むほとんどの細菌は、このようなタンパク質をうまく分泌することができず、タンパク質精製の前に、追加の細胞回収、細胞破壊、および製品分離ステップが必要となる。

ヒューマリンと同様に、異種発現を用いた医薬品開発には多くの成功例があります。目的とする天然生物活性物質を産生する遺伝子のクローニングによる異種発現は、宿主系で発現させ、医薬品生産のためにスケールアップすることも可能です。例えば、臨床的に重要な真菌由来の天然物質の多くは、実験室での培養が困難です。しかし、対応する活性遺伝子クラスターを特定した後、これらの遺伝子を酵母にクローニングして発現させることで、よりコスト効率と時間効率の良い方法で目的の物質を生産することができます。この方法は、新薬の発見にも利用できます。この実験では、これまで研究されていなかった真菌の遺伝子配列を特徴づけて発現させることで、新しい天然物質を生産することが可能になります。^{[ 20 ]}しかし、より生物学的に関連性の高い化合物に向けて遺伝子を突然変異させることで、これを発現させて新しい遺伝子改変物質を得ることができます。^{[ 21 ]}

異種発現のもう 1 つの重要な用途は、より高価で維持が難しい天然システムではなく、宿主システムでさまざまな薬剤をスクリーニングすることです。この例としては、Mycobacterium tuberculosis を直接使用する代わりに、代替の宿主システムとしてMycobacterium marinum を使用することが挙げられます。M . tuberculosis は薬剤スクリーニングに高いバイオセーフティレベルの施設を必要とし、増殖速度が遅いため、プロセスが高価で時間がかかります。そのため、研究者は、近縁で危険性の低いM. marinumをテストし、2 つの薬剤活性化因子の異種発現により、結核薬をテストするための正確なモデルとなりました。^{[ 22 ]}より焦点を絞った薬剤ターゲットを調査する例としては、心疾患に対処するために機能を変化させるさまざまな心臓イオンチャネル薬剤をテストするために、イオンチャネルタンパク質の異種発現があります。 ^{[ 23 ]}同様に、クローン化された受容体の異種発現で薬剤スクリーニングを行うことができます。^{[ 24 ]}ここで異種発現を用いる利点は、目的とする薬剤の標的受容体を大量に生産できることであり、一般的に枯渇することなく、再現性があり、安価である。これらの受容体は、薬剤結合の有効性と特異性を試験するためのアッセイに使用できる。さらに、生産された受容体自体を治療薬として使用できる。これらは毒素や過剰なシグナル伝達分子のデコイとして機能し、これらの分子に結合/減衰させることができる。

組換え技術はバイオ燃料の開発にも貢献している。これは、細菌、植物、酵母に見られる発現系を用いて研究されてきた。特に、セルラーゼ酵素の異種発現は、世界で最も豊富な原料であるセルロースを利用する。セルロース分解酵素は、植物、昆虫、細菌、真菌に存在し、バイオマスをバイオ燃料に変換するのに役立つ。 ^{[ 25 ]}具体的には、セルロースは加水分解されて糖分子を形成する。例えば、真菌宿主では、分解を克服するためにセルロース分解酵素の細胞発現レベルを操作する必要がある。しかし、バイオプロセスでは高収率のタンパク質を生成することが難しく、他の酵素の組み込みが必要となる。さまざまな微生物株を組み合わせて酵素を発現させることで、経済的に実行可能な規模で酵素収率を全体的に増加させることができる。^{[ 25 ]}