サブクローニング

分子生物学において、サブクローニングは、特定の DNA 配列を親ベクターから目的のベクターに移動するために使用される技術です。

サブクローニングは、関連技術である 分子クローニングと混同しないでください。

制限酵素は、親から目的の遺伝子（挿入物）を切り出すために使用されます。挿入物は、他の DNA 分子から分離するために精製されます。一般的な精製方法はゲル分離です。次に、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR） を使用して、遺伝子のコピー数を増幅します。

同時に、同じ制限酵素を使用して、目的のベクターを消化（切断）します。同じ制限酵素を使用する理由は、補完的な 粘着末端を作成し、後でライゲーションを容易にするためです。目的ベクターの自己ライゲーションを防ぐために、ホスファターゼ（通常は子牛腸アルカリホスファターゼ（CIAP））も追加されます。消化された目的ベクターは、分離/精製されます。

次に、インサートと目的ベクターを DNA リガーゼで混合します。インサート遺伝子と目的ベクターの典型的なモル比は 3:1 です。^[1]インサート濃度を上げると、自己連結はさらに減少します。反応混合物を特定の温度で一定時間放置すると (連結される鎖のサイズによって異なります。詳細についてはDNA リガーゼを参照してください)、インサートは目的プラスミドに正常に組み込まれます。

プラスミドは、大腸菌などの細菌に形質転換されることがよくあります。理想的には、細菌が分裂するときにプラスミドも複製される必要があります。最良のシナリオでは、各細菌細胞にプラスミドのコピーがいくつかあるはずです。十分な数の細菌コロニーが成長したら、それらをミニプレップしてプラスミド DNA を採取できます。

形質転換された細菌（収穫すべき目的のプラスミドを運ぶ）だけが確実に増殖するように、マーカー遺伝子が選択用の目的ベクターで使用されます。一般的なマーカー遺伝子は、抗生物質耐性または栄養素生合成用です。したがって、たとえば「マーカー遺伝子」は抗生物質アンピシリン耐性用である可能性があります。目的のプラスミドを拾うはずの細菌が目的の遺伝子を拾っていた場合、それらの細菌は「マーカー遺伝子」も含んでいることになります。これで、プラスミドを拾った細菌はアンピシリンで増殖できるようになりますが、目的のプラスミドを拾わなかった細菌は、依然としてアンピシリンによる破壊に対して脆弱です。したがって、形質転換に成功した細菌は「選択」されます。

この例では、哺乳類遺伝子ライブラリの遺伝子が細菌プラスミド (宛先プラットフォーム) にサブクローン化されます。細菌プラスミドは、プラスミド内の正しい場所に配置すれば細菌が遺伝子産物 (遺伝子発現) を生成できるようにする制御要素を含む環状 DNA です。生成部位は、互換性のない粘着末端を持つ 2 つの制限酵素切断部位「A」と「B」に挟まれています。

哺乳類の DNA にはこれらの制限部位がないため、オーバーラップ拡張 PCRによって組み込まれます。プライマーは、タンパク質のコーディングがフレーム内に収まるように、またタンパク質の両側に追加されるアミノ酸が最小限になるように、制限部位を慎重に配置するように設計されます。

新しい制限部位を持つ哺乳類遺伝子を含む PCR 産物と目的のプラスミドの両方を制限消化し、消化産物をゲル電気泳動によって精製します。

消化産物は、互いに互換性のある粘着末端（ただし、それ自体とは互換性のない粘着末端）を含むようになり、連結されて、異なる挿入を持つ元のプラスミドの背景要素を含む新しいプラスミドが作成されます。

プラスミドは細菌に形質転換され、挿入物の同一性はDNA 配列決定によって確認されます。

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