CRISPR干渉

CRISPR干渉（CRISPRi ）は、原核細胞と真核細胞における遺伝子発現の配列特異的抑制を可能にする遺伝子撹乱技術である。 ^[1]これは、ウェンデル・リム、アダム・アーキン、ジョナサン・ワイスマン、ジェニファー・ダウドナの研究室でスタンレー・チーとその同僚によって最初に開発されました。^[2]遺伝子発現の配列特異的活性化は、CRISPR活性化（CRISPRa）を指します。

細菌の遺伝的免疫システムであるCRISPR（クラスター化規則的間隔の短い回文反復配列）経路に基づいて、^{[3]この技術は}RNA干渉 に対する補完的なアプローチを提供します。ただし、CRISPRiとRNAiの違いは、CRISPRiが主に転写レベルで遺伝子発現を制御するのに対し、RNAiはmRNAレベルで遺伝子を制御することです。

多くの細菌とほとんどの古細菌は、CRISPR RNA (crRNA) と CRISPR 関連 (cas) 遺伝子を組み込んだ適応免疫システムを持っています。

CRISPR干渉（CRISPRi）技術は、2013年初頭にカリフォルニア大学サンフランシスコ校のLei S. Qiと研究者によって初めて報告されました^。[2]この技術は、エンドヌクレアーゼ活性を欠く触媒不活性Cas9（通常dCas9と表記）タンパク質を使用して、RNA誘導方式で遺伝子を制御します。標的の特異性は、ゲノム遺伝子座に対するシングルガイドRNA （sgRNA）の相補的塩基対形成によって決定されます。sgRNAはキメラ非コードRNAであり、20 ntの塩基対形成配列、42 ntのdCas9結合ヘアピン、および40 ntのターミネーターの3つの領域に細分できます（細菌、 ^{[4] [5] [6]}酵母、^[7]ショウジョウバエ、^[8]ゼブラフィッシュ、^[9]マウス^[10]）。

合成 sgRNA を設計する場合、20 nt の塩基対形成配列のみが修正されます。二次変数も考慮する必要があります。オフターゲット効果 (これには塩基対形成配列の単純な BLAST 実行が必要です)、dCas9 結合ヘアピン構造の維持、および修正された sgRNA に制限部位が存在しないことを確認すること (制限部位があると下流のクローニング手順で問題が発生する可能性があるため)。sgRNA 設計は単純なため、この技術はゲノム全体のスケーリングに適しています。^[11] CRISPRi は、触媒的に不活性な Cas9 の生成に依存しています。これは、Cas9 をコードする遺伝子の 2 つの触媒残基 (D10A と H840A) に点変異を導入することによって実現されます。^[12]そうすることで、dCas9 は dsDNA を切断できなくなりますが、DNA を標的とする能力は保持されます。sgRNA と dCas9 は一緒になって、遺伝子特異的制御のための最小限のシステムを構成します。^[2]

CRISPRi は、転写開始または伸長のいずれかをブロックすることで、立体的に転写を抑制できます。これは、プロモーターまたはエクソン配列に相補的な sgRNA を設計することで実現します。コーディング配列内のターゲットによる転写抑制のレベルは、鎖特異的です。CRISPR エフェクターの性質に応じて、テンプレートまたは非テンプレート鎖のいずれかがより強い抑制につながります。^[13] dCas9 (タイプ 2 CRISPR システムに基づく) の場合、ガイド RNA が非テンプレート鎖に相補的である場合に抑制がより強くなります。これは、sgRNAがテンプレート鎖に相補的である場合にRNA pol IIの前で RNA:DNA ヘテロ二重鎖をほどくヘリカーゼの活性によるものであると示唆されています。転写伸長ブロックとは異なり、転写開始部位をターゲットとする場合、サイレンシングはターゲット DNA 鎖とは無関係です。原核生物では、この立体阻害により標的遺伝子の転写をほぼ 99.9% 抑制できます。古細菌では、90% を超える抑制が達成されました。 ^[14]ヒト細胞では、最大 90% の抑制が観察されました。^[2] 細菌では、dCas9 複合体の十分なレベルで標的を飽和させることが可能です。この場合、抑制の強さは、ガイド配列によって決定される RNA ポリメラーゼとの衝突時に dCas9 が排出される確率にのみ依存します。^[15]温度が高いと排出確率も高くなり、抑制が弱くなります。^[15] 真核生物では、CRISPRi はエフェクタードメインを介して転写を抑制することもできます。リプレッサードメインを dCas9 に融合すると、ヘテロクロマチン化を誘導して転写をさらに抑制できます。例えば、よく研究されているKrüppel関連ボックス（KRAB）ドメインをdCas9に融合すると、ヒト細胞内で標的遺伝子の転写を最大99％抑制することができます。^[16]

触媒活性Cas9ヌクレアーゼによるゲノム編集は不可逆的なオフターゲットゲノム改変を伴う可能性があるが、CRISPRiは2つの異なるsgRNA配列に対して非常に特異的であり、オフターゲットの可逆的影響は最小限である。^[16]それにもかかわらず、転写調節の効率を改善するためにいくつかの方法が開発されている。標的遺伝子の転写開始部位を特定し、sgRNAの好みを考慮すると、標的部位にアクセス可能なクロマチンが存在するのと同様に、効率が向上する。 ^[17]

前述の他の改善点とともに、転写開始点からの距離や局所的なクロマチン状態などの要因は、活性化/抑制効率を決定する上で重要なパラメータとなる可能性がある。dCas9とsgRNAの発現、安定性、核局在、相互作用の最適化により、哺乳類細胞におけるCRISPRi効率がさらに向上する可能性がある。^[2]

真核生物のゲノムのかなりの部分（レポーター遺伝子と内因性遺伝子の両方）は、レンチウイルス構造を使用してdCas9とsgRNAを発現させることで標的化できることが示されており、RNAiやTALEタンパク質などの既存の技術と同等の効率性があります。^[16] CRISPRiは、RNAiと併用するか、独自のシステムとして使用することで、RNAiと 同じ用途を達成できます。

細菌の場合、CRISPRiによる遺伝子ノックダウンはグラム陰性大腸菌 ^{[4] [6]}とグラム陽性枯草菌^[5]の両方で完全に実施され、特徴づけ（オフターゲット解析、リーキー抑制）されています。

細菌だけでなく古細菌（例：M. acetivorans）でもCRISPRi-Cas9を利用して窒素固定に関わるいくつかの遺伝子/オペロンをノックダウンすることに成功した。^[14]

異なる遺伝子発現は、標的遺伝子座へのsgRNA塩基対形成の効率を変更することによって達成できる。^[11]理論的には、この効率を調節することで、任意の遺伝子の対立遺伝子シリーズを作成し、本質的にはハイポモルフとハイパーモルフのコレクションを作成することができる。これらの強力なコレクションは、あらゆる遺伝子調査の調査に使用できる。ハイポモルフの場合、これにより、遺伝子ノックアウトのバイナリ特性やノックダウンの予測不可能性とは対照的に、遺伝子機能の段階的な削減が可能になる。ハイパーモルフの場合、これは、可変強度のプロモーター下で目的の遺伝子をクローニングする従来の方法とは対照的である。

蛍光タンパク質をdCas9に融合することで、生きたヒト細胞内のゲノム遺伝子座を画像化することができます。^[18]蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）と比較して、この方法は染色体遺伝子座の動的な追跡を独自に可能にします。これは、HeLa細胞を含む実験室細胞株におけるクロマチン構造と核組織のダイナミクスの研究に使用されてきました。

CRISPRaによる山中因子の活性化は、ヒトおよびマウスの細胞で多能性を誘導するために使用されており、iPS技術の代替手段を提供しています。^{[19] [20]}さらに、大規模な活性化スクリーニングは、誘導多能性を促進するタンパク質、または逆に特定の細胞系統への分化を促進するタンパク質を特定するために使用できます。^[21]

dCas9-SunTagと単一のsgRNAを使用して遺伝子発現をアップレギュレーションする能力は、遺伝子発現の増加または減少から生じる表現型を明らかにするためのPerturb-seqなどの大規模な遺伝子スクリーニングへの扉を開き、これは癌における遺伝子調節の影響を理解する上で特に重要となる。 ^{[22]さらに、CRISPRiシステムは、}細菌接合などの水平遺伝子伝達メカニズムを介して伝達可能であることが示されており、受容細胞におけるレポーター遺伝子の特異的抑制が実証されている。CRISPRiは、遺伝子スクリーニングおよび潜在的に細菌集団制御のツールとして機能する可能性がある。^[23]

1. CRISPRiは、最大99.9%の抑制率で標的遺伝子をサイレンシングすることができる。^[11]抑制の強さは、ガイドRNAと標的間の相補性の量を変えることによっても調整できる。誘導性プロモーターとは異なり、CRISPRiによる部分抑制は、標的の発現に転写ノイズを追加しない。 ^[15]抑制レベルはDNA配列にコード化されているため、さまざまな発現レベルを競合させて増殖させ、配列決定によって特定することができる。^[24]
2. CRISPRiはsgRNA-DNAとNGG PAMモチーフのワトソン・クリック塩基対合に基づいているため、ゲノム内の標的部位の選択は簡単かつ柔軟です。慎重に定義されたプロトコルが開発されています。^[11]
3. 複数の sgRNA は、複数の異なる遺伝子を同時に制御する (マルチプレックス CRISPRi) だけでなく、同じ遺伝子ターゲットを制御する効率を高めるためにも使用できます。多くの sgRNA を同時に発現するための一般的な戦略は、複数のプロモーターまたは処理要素を使用して sgRNA を単一のコンストラクトに配列することです。たとえば、Extra-Long sgRNA Arrays (ELSAs) は、非反復部分を使用して、遺伝子合成プロバイダーからの 12 個の sgRNA アレイの直接合成を可能にし、相同組換えを起こさずに大腸菌ゲノムに直接統合でき、同時に多くの遺伝子をターゲットにして複雑な表現型を実現できます。^[25]
4. 2つのシステムは補完的であるが、CRISPRiはRNAiよりも優れている。外因性システムであるCRISPRiは、マイクロRNAの発現や機能などの内因性機構と競合しない。さらに、CRISPRiはDNAレベルで作用するため、非コードRNA、マイクロRNA、アンチセンス転写、核局在RNA、ポリメラーゼIII転写などの転写を標的にすることができる。最後に、CRISPRiははるかに大きな標的化可能な配列空間を有しており、プロモーターや、理論的にはイントロンも標的にすることができる。^[16]
5. 大腸菌では、遺伝子ノックダウン株の構築は非常に速く、1ステップのオリゴ組換えのみを必要とします。^[6]

1. プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）配列の必要性により、潜在的な標的配列の数が制限される。Cas9とその相同遺伝子は異なるPAM配列を使用する可能性があるため、理論的には潜在的な標的配列の数を増やすために利用できる可能性がある。^[11]
2. 標的遺伝子座に対する配列特異性はわずか14nt長（sgRNAの12ntとPAMの2nt）で、ヒトゲノムでは約11回繰り返される可能性がある。^[11]抑制は、標的部位から転写開始部位までの距離と逆相関している。ゲノム全体の計算予測や、より長いPAMを持つCas9ホモログの選択により、非特異的な標的化が減少する可能性がある。
3. 内因性のクロマチン状態と修飾は、dCas9-sgRNA複合体の配列特異的結合を妨げる可能性がある。^[11] 哺乳類細胞における転写抑制のレベルは遺伝子によって異なります。結合と制御効率に関連して局所DNA構造とクロマチンの役割を理解するには、多くの研究が必要です。
4. CRISPRiは標的遺伝子に近接する遺伝子に影響を与えることができる。これは、他の遺伝子と重複する遺伝子（センスまたはアンチセンスの重複）や双方向プロモーターによって駆動される遺伝子を標的とする場合、特に重要である。^[26]
5. 真核生物では配列特異的な毒性が報告されており、PAM近位領域のいくつかの配列は大きな適応度負荷を引き起こしている。^[27]「悪い種子効果」と呼ばれるこの現象はまだ説明されていないが、dCas9の発現レベルを最適化することで軽減できる。^[28]