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ウレアーゼ（EC 3.5.1.5）は、機能的にはアミドヒドロラーゼおよびホスホトリエステラーゼのスーパーファミリーに属します。 [ 2 ]ウレアーゼは、多数の細菌、古細菌、真菌、藻類、植物、および一部の無脊椎動物に見られます。ウレアーゼは、高分子量ニッケル含有金属酵素です。 [ 3 ]ウレアーゼは、尿酸を豊富に含む鳥類の糞便の分解に重要であり、その分解産物は尿素であり、ここで説明するようにウレアーゼによって分解されます。
これらの酵素は、尿素を加水分解して二酸化炭素とアンモニアに分解する反応を触媒する。
尿素の加水分解は2段階で起こる。第1段階では、アンモニアとカルバミン酸が生成される。カルバミン酸は自発的に急速に加水分解されてアンモニアと炭酸になる。ウレアーゼの活性により、塩基性であるアンモニアが生成されるため、周囲のpHが上昇する。
ウレアーゼ活性は、1876年にフレデリック・アルフォンス・ムスクルスによって可溶性発酵物として初めて同定されました。[ 4 ] 1926年、ジェームズ・B・サムナーは、結晶化したウレアーゼを調べることで、ウレアーゼがタンパク質であることを示しました。[ 5 ]サムナーの研究は、タンパク質が酵素として機能できることを初めて実証したものであり、最終的にはほとんどの酵素が実際にはタンパク質であるという認識につながりました。ウレアーゼは、最初に結晶化された酵素です。この研究により、サムナーは1946年にノーベル化学賞を受賞しました。 [ 6 ]ウレアーゼの結晶構造は、1995年にPAカルプラスによって初めて解明されました。[ 5 ]
ウレアーゼは、尿素をアンモニウムとCO2に変換する反応における重要な触媒として窒素循環において重要な役割を担っているため重要である。ウレアーゼは土壌酵素として存在しており、これは土壌微生物が尿素分解によってアンモニウムの形で利用可能になった窒素から利益を得ているためと考えられる。[ 7 ]
1984年のジャックビーン由来ウレアーゼに関する研究では、活性部位に一対のニッケル中心が含まれていることがわかった。[ 8 ] また、ニッケルの代わりにマンガンやコバルトを用いて試験管内での活性化も達成されている。 [ 9 ] 鉛塩は阻害作用を示す。
ジャックビーンウレアーゼの分子量は480 kDaまたは545 kDaである（アミノ酸配列から計算された質量）。1分子あたり840個のアミノ酸があり、そのうち90個はシステイン残基である。[ 10 ]
最適pHは7.4、最適温度は60 ℃である。基質としては尿素およびヒドロキシ尿素が挙げられる。
細菌ウレアーゼは、1つの大きな触媒サブユニット（α 60～76kDa）と2つの小さなサブユニット（β 8～21kDa、γ 6～14kDa）からなる3つの異なるサブユニットで構成され、一般的に2回対称構造を持つ（αβγ）3三量体の化学量論を形成します（上の図は非対称単位の構造を示しており、真の生物学的集合体の3分の1であることに注意してください）。これらはシステインに富む酵素であり、その結果、酵素のモル質量は190～300kDaになります。[ 10 ]
ヘリコバクター属から優れたウレアーゼが得られます。これは、α(26–31 kDa)とβ(61–66 kDa)の2つのサブユニットから構成されています。これらのサブユニットは、αβ12の十二量体複合体を形成します。[ 11] α-βサブユニットが繰り返され、結合したサブユニットの各ペアに活性部位があり、合計12個の活性部位があります。[11] プロトンゲート型尿素チャネルを介して尿素がペリプラズムに入ることを可能にすることで胃酸を中和し、生存に不可欠な機能を果たします。[ 12 ]ウレアーゼの存在は、ヘリコバクター属の診断に使用されます。
細菌のウレアーゼはすべて細胞質にのみ存在しますが、ヘリコバクター・ピロリのウレアーゼは細胞質活性に加えて宿主細胞との外部活性も持ちます。対照的に、植物のウレアーゼはすべて細胞質に存在します。[ 10 ]
真菌および植物のウレアーゼは、同一のサブユニット（それぞれ約90 kDa）で構成されており、最も一般的には三量体および六量体として組み立てられています。たとえば、ジャックビーンウレアーゼは、2つの構造サブユニットと1つの触媒サブユニットを持っています。αサブユニットは活性部位を含み、1分子あたり840個のアミノ酸（90個のシステイン）で構成され、Ni(II)イオンを含まない分子量は90.77 kDaです。12個のニッケルイオンを含む六量体の質量は545.34 kDaです。植物ウレアーゼのホモ六量体構造の他の例としては、ダイズ、キマメ、およびワタ種子の酵素が挙げられます。[ 10 ]
異なる種類のサブユニットで構成されているにもかかわらず、細菌から植物、真菌に至るまで、さまざまな由来のウレアーゼはアミノ酸配列の高い相同性を示します。単一の植物ウレアーゼ鎖は、融合したγ-β-α構造に相当します。ヘリコバクターの「α」は通常の細菌のγ-βサブユニットの融合に相当し、その「β」サブユニットは通常の細菌のαに相当します。[ 10 ] 3つの鎖からなる構造は祖先的なものであると考えられます。[ 13 ]
尿素の処理におけるウレアーゼのk cat / K mは、尿素の非触媒脱離反応の速度よりも10 14倍大きい。[ 5 ]自然界では、この観察結果には多くの理由がある。尿素が活性部位の活性基に近接していることと、尿素の正しい配向により、加水分解が迅速に起こる。尿素は、その共鳴構造をとることができるため、単独で非常に安定している。尿素の安定性は、その共鳴エネルギーによるものと理解されており、その値は 30～40 kcal/mol と推定されている。[ 5 ]これは、両性イオン共鳴構造はすべてカルボニル炭素に電子を供与するため、求電子性が低下し、求核攻撃に対する反応性が低下するためである。[ 5 ]
ウレアーゼの活性部位はα（アルファ）サブユニットに位置します。これはビス-μ-ヒドロキソ二量体ニッケル中心で、原子間距離は約3.5 Åです。[ 5 ] > Ni(II)ペアは弱い反強磁性で結合しています。[ 14 ] Canavalia ensiformis （ジャックビーン）、Klebsiella aerogenes 、およびSporosarcina pasteurii （以前はBacillus pasteuriiとして知られていた）[ 15 ]のX線吸収分光法（XAS）研究では、ニッケル1個あたり2つのイミダゾール配位子を含む、O/N配位のみを持つ5～6配位ニッケルイオンが確認されています。[ 9 ]尿素基質はアクア配位子を置換すると考えられています。
活性部位の開口部付近に位置する水分子は、水素結合を介して空洞部位を満たす四面体クラスターを形成する。いくつかのアミノ酸残基は、基質のゲートとなる部位の可動フラップを形成すると考えられている。[ 3 ]システイン残基は酵素のフラップ領域によく見られるが、触媒作用には必須ではないと判明しており、活性部位の他の重要な残基を適切に配置するのに関与している。[ 16 ] Sporosarcina pasteuriiウレアーゼでは、フラップは開いたコンフォメーションで見つかっているが、反応には閉じたコンフォメーションが必要であることは明らかである。[ 15 ]
比較すると、ヘリコバクター・ピロリのウレアーゼと他の細菌のウレアーゼのαサブユニットは、ジャックビーンのウレアーゼと一致します。[ 16 ]
尿素がウレアーゼの活性部位に結合することは観察されていない。[ 10 ]
ウレアーゼによるこの反応の触媒作用のメカニズムの一つは、BlakelyとZernerによって提案された。[ 17 ]この反応は、尿素分子のカルボニル酸素による5配位Ni（Ni-1）への求核攻撃から始まる。弱く配位した水配位子がその場所に置き換えられる。尿素分子の窒素原子の1つからの孤立電子対が中心炭素と二重結合を形成し、配位した基質のNH2−が近くの正に帯電した基と相互作用する。BlakelyとZernerは、この近くの基はカルボキシレートイオンであると提案したが、脱プロトン化されたカルボキシレートは負に帯電している。
6配位のニッケル上の水酸化物配位子は塩基によって脱プロトン化される。続いて、カルボニル炭素が電気陰性度の高い酸素によって攻撃される。窒素-炭素二重結合からの電子対が窒素に戻り、その電荷を中和する一方、4配位となった炭素は中間的な四面体構造をとる。
この中間体の分解は、活性部位付近に位置するシステインのスルフィドリル基によって促進される。水素が窒素原子の1つに結合し、炭素との結合を切断してNH₃分子を放出する。同時に、酸素と6配位ニッケルとの結合が切断される。これにより、5配位ニッケルに配位したカルバメートイオンが残り、これが水分子によって置換され、酵素が再生される。
ハウジンガーとカルプラスが提案したメカニズムは、ブレイクリーとゼルナーの経路で明らかになったいくつかの問題を修正しようとし、尿素結合ポケットを構成する側鎖の位置に焦点を当てています。[ 5 ] K. aerogenesウレアーゼ の結晶構造から、ブレイクリー機構で使用される一般塩基である His 320は、攻撃する水酸化物部分を形成するために脱プロトン化するには Ni2 に結合した水から遠すぎると主張されました。さらに、尿素窒素をプロトン化するために必要な一般酸性リガンドは特定されていませんでした。[ 19 ]ハウジンガーとカルプラスは、His 320リガンドのプロトン化された形態が一般酸の役割を果たし、Ni2 に結合した水がすでに脱プロトン化状態にあるという逆プロトン化スキームを提案しています。[ 5 ] 機構は同じ経路をたどり、一般塩基は省略され（もはや必要ないため）、His 320がプロトンを供与してアンモニア分子を形成し、それが酵素から放出される。His 320リガンドと結合水の大部分は活性型（それぞれプロトン化および脱プロトン化）ではないが、ウレアーゼ酵素全体の約 0.3% が常に活性であると計算された。[ 5 ] 論理的には、これは酵素の効率があまり高くないことを示唆するが、確立された知識に反して、逆プロトン化スキームの使用は活性型の反応性を高める利点をもたらし、欠点を相殺する。[ 5 ] His 320リガンドを機構の必須コンポーネントとして配置することは、酵素の可動フラップ領域も考慮に入れている。このヒスチジンリガンドは可動フラップの一部であるため、触媒作用のための尿素基質の結合により、活性部位を覆うこのフラップが閉じられ、ポケット内の他のリガンドからの尿素への水素結合パターンが加わることで、ウレアーゼ酵素の尿素に対する選択性が示される。[ 5 ]
CiurliとMangani [ 20 ]が提案したメカニズムは、ウレアーゼのメカニズムに関するより最近の、そして現在受け入れられている見解の1つであり、主に活性部位の2つのニッケルイオンの異なる役割に基づいています。 [ 15 ]一方のニッケルイオンは尿素に結合して活性化し、もう一方のニッケルイオンは求核性水分子に結合して活性化します。[ 15 ] この提案に関して、可動性の「フラップ」（尿素が活性部位に入ることを可能にする）が開いているときに、尿素は活性部位の空洞に入ります。活性部位への尿素の結合の安定性は、基質を触媒空洞に配向させる水素結合ネットワークによって達成されます。 [ 15 ]尿素は、カルボニル酸素原子 で5配位ニッケル（Ni1）に結合します。尿素は、アミノ基の1つで6配位ニッケル（Ni2）に近づき、その後、2つのニッケル中心を架橋します。[ 15 ] 尿素カルボニル酸素原子の Ni1 への結合は His α222 Nԑ のプロトン化状態によって安定化される。さらに、可動フラップの開状態から閉状態へのコンフォメーション変化により、Ala α222カルボニル基が再配置され、その酸素原子が Ni2 を向くようになる。[ 15 ] Ala α170と Ala α366は、カルボニル基が尿素の NH 2基への水素結合受容体として作用するように配向され、Ni2 への結合を助ける。[ 15 ]尿素は、 NH 2基のルイス塩基性が低いため、 非常に弱いキレート配位子である。しかし、Ala α170と Ala α366のカルボニル酸素はNH 2基の塩基性を高め、Ni2 への結合を可能にする。[ 15 ]したがって、この提案されたメカニズムでは、活性部位における尿素の位置は、Ni1 の近傍で水素結合供与体として、Ni2 の近傍で受容体として機能するように配置されている活性部位残基の構造的特徴によって誘導されます。[ 15 ] Ciurli/Mangani メカニズムと他の 2 つのメカニズムの主な構造上の違いは、窒素、酸素架橋尿素が組み込まれており、それが架橋水酸化物によって攻撃されることです。[ 18 ]
細菌性ウレアーゼは、多くの疾患の病因となることが多い。これらは肝性脳症／肝性昏睡、感染性結石、消化性潰瘍と関連している。[ 21 ]
感染によって誘発される尿路結石は、ストルバイト（MgNH 4 PO 4 •6H 2 O）と炭酸アパタイト[Ca 10 (PO 4 )6•CO 3 ]の混合物です。[ 21 ]これらの多価イオンは可溶性ですが、尿素加水分解中に微生物ウレアーゼからアンモニアが生成されると、周囲の環境のpHが約6.5から9に上昇するため、不溶性になります。 [ 21 ]その結果生じるアルカリ化により、結石が結晶化します。[ 21 ]ヒトでは、微生物ウレアーゼであるProteus mirabilisが、感染によって誘発される尿路結石で最も一般的です。[ 22 ]
研究によると、ヘリコバクター・ピロリ菌は肝硬変とともに肝性脳症や肝性昏睡を引き起こすことが示されています。[ 23 ]ヘリコバクター・ピロリ菌は 胃に微生物ウレアーゼを放出します。ウレアーゼは尿素を加水分解してアンモニアと炭酸を生成します。細菌は胃に局在するため、生成されたアンモニアは胃腔から循環系に容易に取り込まれます。[ 23 ]これにより、血液中のアンモニア濃度が上昇し、高アンモニア血症として知られる状態になります。ヘリコバクター・ピロリ菌の除菌により、アンモニア濃度が著しく低下することが示されています。[ 23 ]
ヘリコバクター・ピロリ菌は、報告された症例の 55～68% で発現する消化性潰瘍の原因でもある。[ 24 ]これは、病原菌の除菌後に潰瘍出血と潰瘍再発 が減少したことで確認された。[ 24 ]胃では、尿素加水分解の結果として粘膜のpHが上昇し、胃腺と胃腔間の水素イオンの移動が妨げられる。[ 21 ] さらに、高濃度のアンモニアは細胞間タイトジャンクションに影響を与え、透過性を高め、胃の粘膜を破壊する。[ 21 ] [ 25 ]
尿素は自然界に存在し、人工的に導入されることもあり、世界中で使用されている合成窒素肥料の半分以上を占めています。[ 26 ]尿素は微生物のウレアーゼによって急速に分解されるため、通常は残留しないにもかかわらず、尿素の多用は富栄養化 を促進すると考えられています。 [ 27 ] 環境中のウレアーゼ活性は、微生物群集の健全性の指標としてよく測定されます。植物がない場合、土壌中のウレアーゼ活性は一般的に従属栄養微生物に起因すると考えられていますが、一部の化学合成独立栄養性アンモニウム酸化細菌は、炭素、窒素、エネルギーの唯一の供給源として尿素上で増殖できることが実証されています。[ 28 ]
ウレアーゼの阻害は、尿素系肥料の急速な分解が無駄であり環境に有害であるため、農業において重要な目標である。[ 29 ]フェニルホスホロジアミデートとN- ( n-ブチル)チオホスホリックトリアミドは、そのような阻害剤の2つである。[ 30 ]
ウレアーゼは炭酸カルシウムの形成を促進することで、バイオミネラリゼーションに着想を得たプロセスに潜在的に有用である。[ 31 ]特に、微生物によって誘導される炭酸カルシウムの形成は、バイオコンクリートの製造に利用できる。[ 32 ]
ウレアーゼ（特に植物由来のもの）は、酵素として作用するだけでなく、触媒機能が失われても持続する追加的な効果も持っています。これには、昆虫毒性、真菌の阻害、哺乳類における神経毒性、哺乳類におけるエンドサイトーシスと炎症性エイコサノイド産生の促進、細菌における走化性の誘導などが含まれます。これらの活動は防御機構の一部である可能性があります。[ 13 ]
ウレアーゼの昆虫毒性は、ジャックビーンウレアーゼの相同アイソフォームであるカナトキシンで最初に確認されました。ペプチドの消化により、この効果に最も関与する10 kDaの部分が特定され、ジャブレトックスと名付けられました。ダイズウレアーゼの類似部分はソユレトックスと名付けられています。昆虫に関する研究では、タンパク質全体が消化を必要とせずに毒性を示すことが示されています。それにもかかわらず、「ウレトックス」ペプチドは毒性がより濃縮されているため、生物農薬として有望です。[ 13 ]
多くの消化管または尿路の病原体はウレアーゼを産生するため、ウレアーゼの検出は病原体の存在を検出するための診断法として利用できる。
ウレアーゼ陽性病原体には以下が含まれる：
さまざまな構造ファミリーのウレアーゼ阻害剤が広く知られています。ウレアーゼの阻害は農業だけでなく、H. pyloriのような病原体が生存メカニズムとしてウレアーゼを産生するため医学においても重要です。阻害剤の既知の構造クラスには以下が含まれます。[ 34 ] [ 35 ]
1926年にサムナーがアセトン溶媒和と遠心分離を用いて初めて結晶として単離した。[ 37 ]現代の生化学ではウレアーゼの需要が高まっている。ジャックビーンミール[ 38 ] 、スイカの種[ 39 ]、エンドウ豆の種[ 40 ]はすべてウレアーゼの有用な供給源であることが証明されている。