凍結保存

制御速度および緩慢凍結（緩慢プログラム凍結（SPF）とも呼ばれる） ^{[ 19 ]}は、細胞を 数時間かけて約-196℃まで冷却する技術である。

緩慢プログラム凍結は1970年代初頭に開発され、最終的に1984年にヒト初の凍結胚出産につながりました。それ以来、プログラム可能なシーケンスまたは制御された速度を使用して生物学的サンプルを凍結する装置は、ヒト、動物、細胞生物学で使用されてきました。サンプルを「凍結」して、最終的に解凍する前に、液体窒素で凍結または凍結保存するために、サンプルをよりよく保存します。このような装置は、世界中の病院、動物病院、研究室で、卵母細胞、皮膚、血液製品、胚、精子、幹細胞、および一般的な組織の保存に使用されています。たとえば、「緩慢凍結」された凍結胚からの生児出産数は、推定300万～40万、または体外受精（IVF）による出産の約20％と推定されています。^{[ 20 ]}

細胞外液が徐々に凍結する間に十分な水分が細胞から排出されるように冷却速度を十分に遅くすれば、致命的な細胞内凍結は回避できる。細胞外氷結晶の成長と再結晶化を最小限に抑えるために、^{[ 21 ]}アルギン酸塩、ポリビニルアルコール、キトサンなどの生体材料を、従来の低分子凍結保護剤とともに使用して氷結晶の成長を阻害することができる。^{[ 22 ]}その速度は、大きさや水の透過性が異なる細胞によって異なる。グリセロールやジメチルスルホキシド（DMSO）などの凍結保護剤で処理した後、多くの哺乳類細胞には約1℃/分の典型的な冷却速度が適切であるが、この速度は普遍的な最適速度ではない。1 ℃/分の速度は、速度制御式冷凍庫や卓上ポータブル冷凍容器などの装置を使用することで達成できる。^{[ 23 ]}  

複数の独立した研究により、緩慢凍結法を用いて保存された凍結胚は、体外受精において新鮮胚よりも優れている可能性があるという証拠が示されている。これらの研究は、新鮮胚や卵子ではなく凍結胚や卵子を使用することで、死産や早産のリスクが軽減されることを示唆しているが、その正確な理由については現在も研究が続けられている。

ガラス化とは、氷結晶の形成を防ぎ、凍結保存による損傷を防ぐのに役立つ、急速冷凍（超急速冷却）プロセスです。

研究者のグレッグ・フェイとウィリアム・F・ラルは、1980年代半ばに生殖凍結保存にガラス化を導入するのに貢献した。^{[ 24 ]} 2000年現在、研究者らは、ガラス化は氷結晶形成による損傷なしに凍結保存の利点を提供すると主張している。^{[ 25 ]}細胞と生体材料の両方が、高い細胞生存率と機能、構築物の完全性、生体材料の構造を維持するために氷のない状態を維持する必要があるため、組織工学の発展に伴い状況はより複雑になった。組織工学構築物のガラス化は、リリア・クレショワによって最初に報告された。^{[ 26 ]}彼女はまた、卵母細胞のガラス化を達成した最初の科学者でもあり、1999年に生児出産につながった。^{[ 27 ]}臨床凍結保存の場合、ガラス化には通常、冷却前に凍結保護剤の添加が必要である。凍結保護剤は、凍結および融解過程において、細胞内氷結晶形成による有害な影響や溶液の影響から細胞を保護するために、凍結培地に添加される高分子物質です。凍結保護剤は、凍結中の細胞生存率を高め、凝固点を下げ、凍結による細胞膜の損傷を防ぎます。凍結保護剤は、高い溶解性、高濃度での低毒性、低分子量、および水素結合を介して水と相互作用する能力を有しています。

シロップ状の溶液は結晶化する代わりに、非晶質の氷、すなわちガラス化します。結晶化による液体から固体への相変化ではなく、非晶質状態は「固体液体」のようなものであり、この変化は「ガラス転移温度」と呼ばれる狭い温度範囲で起こります。

水のガラス化は急速冷却によって促進され、極めて急速な温度低下（メガケルビン/秒）によって凍結防止剤なしで達成できる。純水でガラス状態に達するのに必要な速度は、2005年までは不可能と考えられていた。^{[ 28 ]}

ガラス化に必要な条件は通常、粘度の上昇と凝固点の低下の2つである。多くの溶質はこれら両方の作用を示すが、一般的に分子が大きいほど、特に粘度への影響が大きい。急速冷却もガラス化を促進する。

確立された凍結保存法では、細胞内の粘度を高め、凍結温度を下げるために、溶質が細胞膜を透過する必要があります。糖類は容易に膜を透過しません。一般的な凍結保護剤であるDMSOなど、膜を透過する溶質は、高濃度では毒性を示すことがよくあります。凍結保存のガラス化における難しい妥協点の1つは、凍結保護剤の毒性による凍結保護剤自体による損傷を制限することです。凍結保護剤の混合物と氷遮断剤の使用により、21st Century Medicine社は独自のガラス化混合物を使用してウサギの腎臓を-135℃でガラス化することに成功 しました。再加温後、腎臓はウサギに移植され、完全な機能と生存能力を備え、唯一の機能する腎臓としてウサギを無期限に維持することができました。^{[ 29 ]} 2000年には、FM-2030が死後にガラス化に成功した最初の人物となりました。^{[ 30 ]}

血液は不活性希ガスや酸素などの代謝的に重要なガスに置き換えることができるため、臓器はより速く冷却され、不凍液の使用量を減らすことができます。組織の領域はガスによって分離されているため、小さな膨張が蓄積されず、それによって粉砕を防ぐことができます。^{[ 31 ]} 小規模企業である Arigos Biomedical は、「すでに零下 120 度から豚の心臓を回収した」と報告していますが、^{[ 32 ]}「回収した」の定義は明確ではありません。60 気圧の圧力は熱交換率を高めるのに役立ちます。^{[ 33 ]} ガスの粘度が低いため、保存された臓器のより多くの領域に到達し、組織 1 グラムあたりより多くの酸素を供給するのに役立つ可能性があるため、ガス酸素灌流/パーサフレーションは静的低温保存や低体温機械灌流に比べて臓器の保存を向上させることができます。^{[ 34 ]}

胚の凍結保存は、例えば体外受精によって現在必要とされるよりも多くの胚が得られた場合などに、胚を保存するために用いられます。

27年間保存された胚から1件の妊娠と健康な出産が報告されているが、これは3年前に同じバッチの胚で妊娠が成功した後のことである。^{[ 45 ]}多くの研究が凍結胚、いわゆる「フロスティ」から生まれた子供を評価している。結果は一様に良好で、先天異常や発達異常の増加は見られない。^{[ 46 ]} 11,000個以上の凍結保存されたヒト胚の研究では、体外受精または卵子提供サイクル、あるいは前核期または分割期に凍結された胚の場合、保存期間が解凍後の生存率に有意な影響を与えないことが示された。^{[ 47 ]}さらに、保存期間は体外受精または卵子提供サイクルのいずれにおいても、臨床妊娠、流産、着床、または生児出産率に有意な影響を与えなかった。^{[ 47 ]}むしろ、卵子の年齢、生存率、および移植された胚の数が妊娠結果の予測因子である。^{[ 47 ]}

卵巣組織の凍結保存は、自然な限界を超えて生殖機能を維持したい女性、または血液悪性腫瘍や乳がんなどの癌治療によって生殖能力が脅かされている女性にとって関心のあるものです。^{[ 48 ] [ 49 ]}この手順では、卵巣の一部を取り出し、治療中に液体窒素で保存する前に緩慢凍結を行います。その後、組織を解凍して卵管の近くに移植することができます。移植は、同所性（自然な位置）または異所性（腹壁）のいずれかで行われ、^{[ 49 ]}移植された組織は新しい卵子を生成し始め、正常な受精が可能になります。^{[ 50 ]}また、移植片拒絶を避けるために、卵巣組織を免疫不全マウス（SCIDマウス）に移植することもでき、成熟卵胞が発達した後に組織を採取することができます。^{[ 51 ]}

ヒト卵子凍結保存は、女性の卵子（卵母細胞）を採取し、凍結保存する新しい技術です。その後、妊娠の準備が整った時点で、卵子を解凍し、受精させ、胚として子宮に移植することができます。1999年、KuleshovaらがHuman Reproduction誌でガラス化融解した女性の卵子から生まれた胚から生まれた最初の赤ちゃんの誕生を報告して以来^{[ 26 ]} 、この概念は認識され、広く普及しました。女性の卵子のガラス化を実現したこの画期的な技術は、卵子のガラス化後の臨床妊娠率が緩慢凍結後の4倍であるため、体外受精プロセスの知識と実践において重要な進歩をもたらしました。^{[ 52 ]}卵母細胞のガラス化は、若い癌患者の妊孕性を維持するため、また、宗教的または倫理的な理由で胚の凍結保存に反対する体外受精を受ける人々にとって不可欠です。

精子は、精子バンクで凍結保存すれば、ほぼ永久的に使用できます。報告されている最長の保存期間は22年です。^{[ 53 ]}精子提供は、受精者が別の時期や場所での治療を希望する場合や、精管切除術や化学療法、放射線療法、手術など、生殖能力を損なう可能性のある治療を受ける男性の生殖能力を温存する手段として使用できます。

未成熟精巣組織の凍結保存は、生殖毒性療法を必要とする少年に生殖能力を提供するための開発中の方法です。凍結精巣細胞懸濁液または組織片の移植後に健康な子孫が得られているため、動物データは有望です。しかし、凍結組織からの生殖能力回復オプション、すなわち細胞懸濁液移植、組織移植、体外成熟は、今のところヒトにおいて有効かつ安全であることが証明されていません。^{[ 54 ]}

コケ植物全体、特にPhyscomitrella patensの凍結保存は、 Ralf Reskiと共同研究者によって開発され^{[ 55 ]} 、国際コケストックセンターで実施されている。このバイオバンクは、コケの変異体とコケの生態型を収集、保存、配布している^{[ 56 ]}。

MSCは、解凍後数時間以内に輸血すると、細胞増殖の対数期にあるMSC（新鮮なMSC）と比較して、機能が低下したり、疾患の治療効果が低下したりする可能性があります。そのため、凍結保存されたMSCは、臨床試験や実験的治療に投与する前に、体外培養で細胞増殖の対数期に戻す必要があります。MSCの再培養は、凍結と解凍中に細胞が受けるショックからの回復に役立ちます。凍結保存された製品を解凍直後に使用したMSCに関するさまざまな臨床試験は、新鮮なMSCを使用した臨床試験と比較して失敗しています。^{[ 57 ]}

植物の凍結保存は、その生物多様性の価値から重要になりつつあります。種子は遺伝情報の重要な伝達システムとして考えられています。低温や低水分含有量に対する耐性が低いため、難保存種子の凍結保存は最も困難です。^{[ 58 ]}しかし、植物ガラス化溶液は問題を解決し、難保存種子（スイレン）の凍結保存に役立ちます。^{[ 59 ]}

菌類、特に接合菌類、子嚢菌類、および高等担子菌類は、胞子形成の有無にかかわらず、液体窒素中または超低温で保存することができます。凍結保存は、胞子を形成しない菌類（胞子の保存には、より低コストで容易な他の保存方法を用いることができます）、胞子を形成するが胞子が繊細な菌類（大型または凍結乾燥に弱い）、病原性菌類（代謝活性のある菌類を保存するのは危険）、または遺伝子ストックとして使用される菌類（理想的には、元の保存物と同一の組成を持つ）にとって、重要な保存方法です。他の多くの生物と同様に、DMSOやグリセロールなどの凍結保護剤（例えば、糸状菌には10%グリセロール、酵母には20%グリセロール）が使用されます。凍結保護剤の選択の違いは種（またはクラス）に依存しますが、一般的に真菌にはDMSO、グリセロール、ポリエチレングリコールなどの浸透性凍結保護剤が最も効果的です（その他の非浸透性凍結保護剤には、マンニトール、ソルビトール、デキストランなどの糖類があります）。凍結融解の繰り返しは生存率を低下させる可能性があるため推奨されません。バックアップ用のディープフリーザーまたは液体窒素保管場所が推奨されます。凍結のための複数のプロトコルが以下にまとめられています（それぞれスクリューキャップ付きポリプロピレン製クライオチューブを使用します）：^{[ 62 ]}

培養可能な一般的な実験室株の多くは、遺伝的にも表現型的にも安定した長期保存株として、超低温で凍結保存されています。^{[ 63 ]}継代培養や長期間の冷蔵保存は、プラスミドの喪失や突然変異につながる可能性があります。一般的な最終グリセロール濃度は15%、20%、25%です。新鮮な培養プレートから、目的のコロニーを1つ選び、液体培養を行います。液体培養液から、培地を等量のグリセロールと直接混合します。コロニーに突然変異などの欠陥がないか確認する必要があります。長期保存する前に、培養液からすべての抗生物質を洗い流す必要があります。方法は様々ですが、混合は反転によって穏やかに行うか、ボルテックスによって急速に行うことができ、冷却は、クライオチューブを直接-50～-95  ℃に置くか、液体窒素で急速凍結するか、徐々に冷却してから-80  ℃以下（液体窒素または液体窒素蒸気）で保存するかのいずれかで行うことができます。細菌の回収率も様々で、例えば、ビーズがチューブ内に保存されている場合は、少量のビーズをプレーティングに使用したり、凍結ストックをループで掻き取ってプレーティングしたりすることができますが、必要なストックは少量なので、チューブ全体を完全に解凍したり、凍結融解を繰り返すことは避けるべきです。方法論に関わらず、100%の回収は不可能です。^{[ 64 ] [ 65 ] [ 66 ]}

土壌に生息する微小な線虫であるパナグロライムス・デトリトファガスとプレクタス・パルバスは、3万年から4万年という長期間の凍結保存後も生存能力を維持できることが証明された唯一の真核生物である。この場合、保存状態は人工的なものではなく、永久凍土による自然なものであった。これらの線虫は、温められると再び活動を始めた。

魚類、両生類、爬虫類を含むいくつかの動物種は凍結に耐えられることが示されている。少なくとも4種のカエル（Pseudacris crucifer、Hyla versicolor、Pseudacris triseriata、Lithobates sylvaticus）と数種のカメ（Terrapene carolina、孵化したばかりのChrysemys picta）、トカゲ、ヘビは凍結耐性があり、凍結を生き延びるための適応を発達させている。一部のカエルは地下や水中で冬眠するが、それでも体温は-5～-7  ℃まで低下し、凍結してしまう。アカガエル（Lithobates sylvaticus）は繰り返し凍結に耐えることができ、その間、細胞外液の約65%が氷に​​変化する。^{[ 63 ]}

ネズミは零度に近い（ただし凍結していない）温度から蘇生したことがある。^{[ 67 ]}