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冷凍動物園とは、精子バンクのような保管施設で、動物から採取した遺伝物質（DNA、精子、卵子、胚、生体組織など）を液体窒素タンク内で極低温（-196 ℃）で保管する施設です。[ 1 ]このように保存された物質は無期限に保存でき[ 2 ] 、人工授精、体外受精、胚移植、クローン作成などに利用できます。世界には、保全活動のためにこの技術を導入している冷凍動物園がいくつかあります。ピレネーアイベックス、クロアシイタチ、そして将来的にはシロサイなど、いくつかの異なる種がこの技術の対象となっています。
最初の冷凍動物園は、1972年に病理学者のクルト・ベニルシュケによってサンディエゴ動物園に設立されました。 [ 3 ] [ 4 ] [ 5 ]当時はコレクションを利用する技術はありませんでしたが、ベニルシュケは将来そのような技術が開発されると信じていました。[ 6 ]冷凍動物園のアイデアは、後にグレゴリー・ベンフォードが1992年に生命の図書館を提案した論文で支持されました。[ 7 ]サンディエゴ動物園のような動物園や、絶滅危惧種研究のためのオーデュボンセンター[ 8 ] [ 2 ]のような研究プログラムは、絶滅危惧種の遺伝子プールの多様性を保護するため、またはタスマニアタイガー[ 9 ]やマンモス[ 10 ]のような絶滅種の将来的な再導入を可能にするために、遺伝物質を冷凍保存しています。
冷凍動物園用の材料を集めるのは、雄に精子が豊富にあるため簡単である。精子は動物の死後に採取することができる。雌では通常少ない卵子の生産は、種に応じてホルモン治療によって10～20個の卵母細胞を得るために増加させることができる。一部の冷凍動物園は、胚が凍結保存プロセスに対してより耐性があるため、卵子を受精させて得られた胚を凍結することを好む。[ 11 ]一部のセンターでは、絶滅危惧種または絶滅種の皮膚細胞サンプルも収集している。スクリップス研究所は、皮膚細胞を誘導多能性幹細胞（ iPS細胞）と呼ばれる特殊な細胞の培養に成功している。理論的には、これらのiPS細胞から精子と卵子を作ることは可能である。[ 4 ]
2021年現在、冷凍保存された動物の細胞がクローン化され、絶滅危惧種の遺伝的多様性を高めている。2003年には絶滅種のクローン作成が試みられたが、生まれたばかりのピレネーアイベックスは発達障害で死亡し、その障害はクローン作成と関連している可能性があり、また、冷凍保存された動物園には、繁殖可能なピレネーアイベックスの個体群を再構築するのに十分な遺伝子サンプルがない。
サンディエゴ動物園の保全研究所にある冷凍動物園には現在、1,300種以上の種と亜種から11,500点の標本が保管されている。[ 12 ] [ 13 ]これは、米国やヨーロッパの他の動物園での同様のプロジェクトの先駆けとなっている。[ 14 ] [ 15 ]しかし、冷凍動物園は世界にまだ12ヶ所未満しかない。[ 2 ]
アラブ首長国連邦シャルジャにある絶滅危惧アラビア野生生物繁殖センター（BCEAW）には、極めて絶滅の危機に瀕しているゴードンヤマネコ（Felis silvestris gordoni）やアラビアヒョウ（Panthera pardus nimr）（野生ではわずか50頭しかいない）などの胚が保管されている。[ 11 ]
ニューオーリンズ大学に付属するオーデュボン絶滅危惧種研究センターは、冷凍動物園を維持している。2000年、同センターは絶滅の危機に瀕しているアフリカヤマネコの凍結融解胚を飼い猫の子宮に移植し、健康なオスのヤマネコが誕生した。[ 16 ]
2007年に設立され、国立動物園・保全生物学研究所（NZCBI）が主導するパン・スミソニアン・クライオ・イニシアチブ（PSCI）は、14,500種の150万を超えるサンプルを収蔵するバイオバンクを管理している。そのコレクションには、200種以上の外来動物から16,000のサンプルを収蔵する専門のミルク保管庫も含まれている。[ 17 ]
マレーシアでは、マレーシア国際イスラム大学（IIUM）が、持続可能な幸福のための惑星生存研究所（PLANETIIUM）内に国内初の冷凍動物園を設立しました。この施設は、特殊な体外受精（IVF）研究所を通じて細胞や組織の長期保存に重点を置いています。2016年、ボルネオサイ同盟（BORA）との協力により、この研究所はマレーシアに残る最後の3頭のスマトラサイから遺伝物質を採取し、保存することに成功しました。[ 18 ]
フローズン・アークは、2004 年に設立され、ロンドン動物学会、ロンドン自然史博物館、ノッティンガム大学が共同で管理する冷凍動物園です。[ 19 ] [ 20 ]この慈善団体はノッティンガム大学に機関としての拠点を維持していますが、研究は現在主にカーディフ大学で行われています。[ 21 ]この組織は、DNA 研究所、コンソーシアム、分類専門家グループ、データベースなど、さまざまな部門を持つ慈善団体として運営されています。[ 22 ] DNA 研究所では、科学者から収集されたサンプルが保管され、さまざまな研究プロジェクトが実施されます。コンソーシアムは、動物園、水族館、博物館、大学など、異なるが重要なグループを結びつける橋渡しの役割を果たします。分類専門家グループは、主要な門を監視し、IUCN レッドリストなどのリストを作成します。データベースは、慈善団体の他のすべての機能を実行するために必要なすべてのレポートと記録を保持しているため、不可欠な部分です。[ 22 ]将来的には、動物園や水族館が、絶滅危惧種や絶滅寸前種のサンプルを施設内で採取し、保全活動に役立てられるようになることが期待されています。[ 22 ]これらのサンプルを採取して冷凍保存することで、個体群間で配偶子を分配することが可能になります。サンプルは、生きている宿主からも、死んだ宿主からも採取できます。[ 22 ] [ 23 ]
ジョージア大学の再生バイオサイエンスセンターは冷凍動物園を建設している。RBC所長のSteven Stice氏と動物・酪農科学助教授のFranklin West氏は、絶滅危惧種のネコ科動物を救うという目的でこの施設を創設した。科学者たちはすでにスマトラトラから細胞を抽出しており、これは人工授精に利用できる可能性がある。人工授精は、解剖学的または生理学的理由により自然な方法で繁殖できない動物に対する治療法となる。保存された遺伝物質の複製は、遺伝的改良を促進し、近親交配を防ぐことも可能にする。現代の技術により、動物を飼育せずに遺伝子操作を行うことができる。しかし、野生への復帰を成功させるには、新しい科学の応用と、以前に収集された十分な量の材料が必要となる。[ 11 ]
必要な温度が非常に低いため、DNA サンプルにはさまざまなレベルのストレスがかかります。特に精子は、温度ショック、浸透圧ストレス、酸化ストレスによってストレスを受け、後者が最も有害です。 [ 24 ]温度ショックが発生すると、精子の凍結と解凍によって膜が損傷します。浸透圧ストレスは、凍結プロセス中に核内に氷の結晶が形成され、細胞内の浸透圧が異なるときに発生します。酸化ストレスは、反応性酸素種 (ROS) が多すぎる結果であり、ROS は非常に反応性が高く、細胞のすべての部分に損傷を与えます。[ 24 ] [ 25 ]これらのストレス要因は細胞内に存在しますが、それぞれに解決策があります。サンプルにコレステロールを導入することで、温度ショックを軽減できます。不凍タンパク質の使用は、浸透圧ストレスに対する解決策の 1 つです。酸化ストレスは、ROSの反応性の高い成分のため、対処が最も難しいが、凍結融解による損傷を制限し、DNAの生存率を高めるために特定のタンパク質を追加するなどの対策がある。[ 24 ]
自然死したガウルの皮膚細胞が凍結され、サンディエゴ冷凍動物園に加えられた。8年後、これらの細胞のDNAが家畜牛の卵子に挿入され、胚が作られた（異種間クローン）。その後、この胚は家畜牛（Bos taurus）に移植された。2001年1月8日、ノアと名付けられたガウルがアイオワ州スーセンターで生まれた。ノアは最初は健康だったが、翌日クロストリジウム腸炎を発症し、生後48時間以内に赤痢で死亡した。これはクローン化されていない動物では珍しいことではなく、研究者たちはクローン化が原因だとは考えていなかった。[ 26 ]
バンテンは、クローン化に成功した2番目の絶滅危惧種であり、幼少期を超えて生存した最初のクローンです。[ 27 ] [ 28 ]マサチューセッツ州ウースターのアドバンスト・セル・テクノロジーの科学者たちは、サンディエゴのフローズン・ズー施設で保存されていた死んだ雄のバンテンの皮膚細胞からDNAを抽出し、それを家畜のバンテンの雌牛の卵子に移植しました。このプロセスは体細胞核移植と呼ばれています。30個の胚が作成され、家畜のバンテンの雌牛に移植されました。2つは満期まで妊娠し、帝王切開で出産されました。1つ目は2003年4月1日に生まれ、2つ目はその2日後に生まれました。2つ目は、巨大児症候群（過成長障害）にかかっていたようで安楽死させられましたが、1つ目は生き残り、サンディエゴ動物園で7年間生き、2010年4月に足を骨折して安楽死させられました。[ 29 ] [ 30 ]
2020年、サンディエゴ動物園グローバル、ViaGen Equine、Revive & Restoreの協力により、初のクローン馬プルツェワルスキーウマが誕生した。[ 31 ]クローン化は体細胞核移植（SCNT）によって行われた。SCNTとは、体細胞のDNAを含む核を、自身の核が除去された未成熟卵細胞（卵母細胞）に移植することで生存可能な胚を作成し、体細胞提供者と遺伝的に同一の子孫を生み出す方法である。[ 32 ]使用された卵母細胞は家畜馬のものであったため、これは異種間SCNTの一例である。[ 33 ]
体細胞ドナーは、1975年に英国で生まれ、3年後に米国に移送され、1998年に死亡したクポロヴィッチという名前のプルツェワルスキーウマの種牡馬でした。飼育下のプルツェワルスキーウマの個体群における遺伝的多様性の喪失に対する懸念と、新しいクローン技術の開発を見越して、この種牡馬の組織はサンディエゴ動物園の冷凍動物園で凍結保存されました。1980年代にこの個体を繁殖させたことで、飼育下の個体群の遺伝的多様性は既に大幅に増加していました。この個体は、当時生きていた他のどの馬よりも多くの固有の対立遺伝子を持っていることが発見され、最初の飼育下の創始者2頭から失われた遺伝物質も含まれていました。 [ 31 ]クローンを作成するために、凍結された皮膚線維芽細胞を解凍し、細胞培養で培養しました。[ 34 ]家畜馬から卵母細胞を採取し、その核を培養したプルツェワルスキーウマ線維芽細胞から採取した核に置き換えた。得られた胚は分裂を開始させ、胚盤胞期に達するまで培養し、その後、家畜馬の代理母馬に移植した。[ 34 ]代理母馬は胚を妊娠期間満了まで育て、すでに亡くなった種牡馬のプルツェワルスキーウマのDNAを持つ子馬を出産した。
クローン馬は、絶滅危惧種とみなされる種の遺伝物質を凍結保存するというアイデアを開発した遺伝学者のクルト・ベニルシュケ博士にちなんでクルトと名付けられました。彼のアイデアは、遺伝子ライブラリーとしてのフローズン動物園の創設につながりました。 [ 35 ]サンディエゴ動物園サファリパークには繁殖群があります。[ 36 ]子馬が成長すると、サンディエゴ動物園サファリパークの繁殖群に移されました。[ 36 ]クポロヴィッチの遺伝子を飼育されているプルツェワルスキーウマのより大きな集団に伝え、種の遺伝的多様性を高めるためです。2023年には、同じ細胞株からオリーという名前の2頭目の馬がクローンされました。[ 31 ]
絶滅危惧種であるクロアシイタチ（Mustela nigripes）の近親交配による遺伝的劣化を軽減するため、 Revive & Restoreは、サンディエゴ動物園野生生物同盟冷凍動物園に保存されている歴史的な細胞株から個体をクローン化する継続的な取り組みを支援しています。このプログラムは、生きた遺伝子プールから失われた遺伝的多様性を回復することを目的としています。
2020年12月10日、世界初のクローン化されたクロアシイタチが誕生した。エリザベス・アンと名付けられたこのイタチは、米国で絶滅危惧種がクローン化に成功した最初の事例となった。[ 37 ] [ 38 ]
1980年代に野生で捕獲され、飼育下で繁殖しなかった2匹のクロアシイタチの細胞が、サンディエゴ野生生物同盟冷凍動物園に保存された。そのうちの1匹は、この種の遺伝的多様性を高めるために2020年12月にクローン化された。両方のクローンをさらに作成する計画がある。クローン化された個体は、最初はクローン化されていない個体群とは別に繁殖される予定である。[ 39 ]
ピレネーアイベックスは2000年に絶滅した。2003年に最後の個体（落下した枝で死んだ雌）の凍結細胞を用いて208個の胚がクローン化され、そのうち7個がヤギに移植され、1個が出産まで至った。その1頭のアイベックスは出生直後に呼吸不全で死亡した。クローン化の過程で肺が適切に発達しなかったことが原因である可能性が高い。繁殖個体群を作るのに十分な数の個体細胞が保存されていない可能性がある。[ 40 ] [ 41 ]アイベックスの死にもかかわらず、DNA分析により、その子孫は最後の生存個体からの正当なクローンであることが明らかになった。[ 42 ]
長年にわたり、北シロサイ（Ceratotherium simum cottoni）の角の価値が密猟者にとって高まるにつれて、個体数の減少に対する懸念が高まってきました。具体的には、個体数は2011年から2019年にかけて約70%減少しました。[ 43 ] SCNTのようなプロセスは、個体数の回復に向けた保全活動に役立つ可能性があります。研究者たちは、無限の可能性を秘めた誘導多能性幹細胞（iPSC）に注目しています。[ 44 ]個体数が限られているため、この亜種内で自然交配が起こらないことから、この亜種は研究者にiPSC介入の機会を提供します。新鮮な精液による人工授精（AI）を含む他の方法は、別の亜種である南シロサイ（Ceratotherium simum simum）で成功裏に使用されています。[ 45 ]凍結融解精子が試験され、いくつかの成功を収めており、種全体の繁殖に関する問題を解決するのに役立っている。[ 45 ]