ヌクレアーゼ保護アッセイ

ヌクレアーゼ保護アッセイは、細胞から抽出された異種 RNA サンプル内の個々のRNA分子を識別するために、生化学および遺伝学で使用される実験技術です。この技術では、総濃度が低くても、既知の配列の 1 つ以上の RNA 分子を識別できます。抽出された RNA は、最初に、目的の配列に相補的なアンチセンスRNA またはDNAプローブと混合され、相補鎖がハイブリダイズされて二本鎖 RNA (または DNA-RNA ハイブリッド) が形成されます。次に、混合物を、一本鎖 RNAのみを特異的に切断し、二本鎖 RNA に対しては活性を持たないリボヌクレアーゼにさらします。反応が完了すると、影響を受けやすい RNA 領域は非常に短いオリゴマーまたは個々のヌクレオチドに分解されます。生き残った RNA フラグメントは、追加されたアンチセンス鎖に相補的であり、したがって目的の配列を含んでいたものです。

プローブは、SP6、T7、または T3 のいずれかのプロモーターの制御下にあるベクターに、目的の遺伝子の一部をクローニングすることによって作成されます。これらのプロモーターは、もともとバクテリオファージから特徴付けられた DNA 依存性 RNA ポリメラーゼによって認識されます。生成されたプローブは、放射性 UTP を使用した in vitro 転写によって作成されるため、放射性です。補完されていない DNA または RNA はヌクレアーゼによって切断されます。プローブが DNA 分子の場合は、S1 ヌクレアーゼが使用されます。プローブが RNA の場合は、任意の一本鎖特異的リボヌクレアーゼを使用できます。したがって、残存するプローブ mRNA 補完物は、オートラジオグラフィーによって簡単に検出されます。

ヌクレアーゼ保護アッセイは、転写された遺伝子領域のイントロンと5'末端および3'末端をマッピングするために使用されます。元の細胞抽出物に存在するターゲット RNA の量に関する定量的な結果が得られます。ターゲットがメッセンジャー RNAである場合、これは細胞内の遺伝子の 転写レベルを示すことができます。

これらは、 RNA 干渉を意味する可能性のある二本鎖 RNA の存在を検出するためにも使用されます。

ノーザンブロッティングは、同様の情報を生成する実験技術です。速度が遅く、定量性も劣りますが、ターゲット RNA のサイズに関する正確な情報も生成します。ヌクレアーゼ保護アッセイ製品は、ヌクレアーゼ消化ステップ中にハイブリダイズしていない RNA が破壊されるため、最初のプローブのサイズに制限されます。

• サンデリン、A. 他「哺乳類RNAポリメラーゼIIコアプロモーター：ゲノムワイド研究からの洞察」Nature Rev. Genet. 8, 424–436 (2007)