チャネルロドプシン

チャネルロドプシンは、光ゲート型イオンチャネルとして機能するレチニリデンタンパク質（ロドプシン）のサブファミリーです。^{[ 1 ]}これらは単細胞緑藻類の感覚光受容体として機能し、光走性（光に対する運動）を制御します。^{[ 2 ]}他の生物の細胞で発現すると、光によって電気的興奮性、細胞内酸性度、カルシウム流入、およびその他の細胞プロセスを制御することができます（オプトジェネティクスを参照）。モデル生物クラミドモナス・ラインハルティ由来のチャネルロドプシン-1（ChR1）とチャネルロドプシン-2（ChR2）は、最初に発見されたチャネルロドプシンです。異なる色の光に敏感な変異体や特定のイオンを選択的に取り込む変異体（ACR、KCR）は、他の藻類や原生生物種からクローン化されています。

微細藻類の光走性と光定位は、世界中の多くの研究室で100年以上にわたって研究されてきた。1980年、ケン・フォスターは藻類の眼の機能に関する最初の一貫した理論を提唱した。^{[ 3 ]}彼はまた、発表された作用スペクトルを分析し、盲細胞をレチナールとレチナール類似体で補完し、緑藻類の運動反応の光受容体はロドプシンであるという結論に至った。^{[ 4 ]}

緑藻類ヘマトコッカス・プルビアリスとクラミドモナス・ラインハルティの光電流は、オレグ・シネシチェコフとピーター・ヘーゲマンの研究グループで長年にわたって研究されてきた。^{[ 5 ] [ 6 ]}作用分光法と光電流および鞭毛拍動の同時記録に基づいて、光受容体電流とそれに続く鞭毛運動はロドプシンによって媒介され、光走性および光忌避反応を制御することが明らかになった。短い光フラッシュ後の光受容体電流の極めて速い上昇は、ロドプシンとチャネルがタンパク質複合体、あるいは単一のタンパク質内で密接に結合しているという結論につながった。^{[ 7 ] [ 8 ]}

この珍しい性質を強調するために「チャネルロドプシン」という名前が付けられ、配列もそれに合わせて改名されました。現在チャネルロドプシンChR1およびChR2と呼ばれるロドプシンのヌクレオチド配列は、C. reinhardtiiの大規模なESTシーケンスプロジェクトで最終的に発見されました。3つの研究グループによる同じ配列のGenBankへの独立した提出により、その命名に関して混乱が生じました。Hegemannのグループは最初の提出にcop-3およびcop-4という名前を使用し^{[ 9 ]} 、 SpudichのグループはcsoAおよびcsoBを使用し^{[ 2 ]}、Takahashiのグループはacop-1およびacop-2を使用しました^{[ 10 ]} 。両方の配列は、アフリカツメガエル卵母細胞およびヒト腎臓細胞（HEK）において、単一成分の光活性化カチオンチャネルとして機能することがわかりました^{[ 1 ] [ 11 ] 。} 

藻類細胞における光受容体電流の生成におけるそれらの役割は、Oleg Sineshchekov、Kwang-Hwan Jung、John Spudich ^{[ 2 ]} 、および Peter Berthold と Peter Hegemann ^{[ 12 ]によって特徴づけられた。}

構造的には、チャネルロドプシンはレチニリデンタンパク質です。ロドプシンと同様に7回膜貫通タンパク質であり、光異性化可能な発色団であるオールトランスレチナール（ビタミンAのアルデヒド誘導体）を含んでいます。レチナール発色団は、プロトン化されたシッフ塩基を介してタンパク質の残りの部分と共有結合しています。ほとんどの7回膜貫通タンパク質は、セカンドメッセンジャーを介して間接的に他のイオンチャネルを開くGタンパク質共役受容体（すなわち、代謝型）であるのに対し、チャネルロドプシンはイオンチャネルを直接形成します（すなわち、イオンチャネル型）。^{[ 11 ]}これにより、細胞の脱分極が非常に速く、頑丈になり、光刺激を含むバイオエンジニアリングや神経科学の応用に役立ちます。

天然の（「野生型」）ChR2は、480 nmで吸収および作用スペクトルが最大となる青色光を吸収します。 ^{[ 14 ]}全トランスレチナール複合体が光子を吸収すると、全トランスから13-シスレチナールへの構造変化が誘発されます。この変化により、膜貫通タンパク質にさらに変化が生じ、孔が少なくとも6 Å開きます。数ミリ秒以内に、レチナールは全トランス型に戻り、孔を閉じてイオンの流れを止めます。^{[ 11 ]ほとんどの天然チャネルロドプシンは、H +}、Na ⁺、K ⁺、およびCa ²⁺イオンを伝導する非特異的カチオンチャネル（CCR）です。 陰イオン伝導性チャネルロドプシン（ACR）^{[ 15 ]}とカリウム選択性チャネルロドプシン（HcKCR1、HcKCR2）^{[ 16 ]}の構造解析により、そのイオン選択性が理解された。^{[ 17 ] [ 18 ]} ACRとKCRは神経活動の抑制に用いられてきた。最近発見されたウイルス性チャネルロドプシン（VCR1）は小胞体膜に局在し、光照射によってカルシウム放出を引き起こす。^{[ 19 ]}  

2005年、3つのグループが相次いでChR2を、神経細胞、神経回路、および行動の遺伝的に標的化された光学的遠隔制御（オプトジェネティクス）のためのツールとして確立した。

当初、カール・ダイセロスの研究室は、ChR2 が試験管内で哺乳類のニューロンを制御するために使用できることを実証し、ミリ秒オーダーの時間精度 (スパイクまでの遅延と時間的ジッターの両方に関して) を達成しました。^{[ 20 ]}すべてのオプシンは光感知補因子としてレチナールを必要とするため、哺乳類の中枢神経細胞が十分なレチナールレベルを含んでいるかどうかは不明でしたが、実際には含まれています。また、小さな単一チャネルコンダクタンスにもかかわらず、哺乳類のニューロンを活動電位閾値以上に駆動するのに十分な効力があることも示しました。このことから、チャネルロドプシンは、ニューロンが動作する時間精度 (ミリ秒) で神経活動を制御できる最初の光遺伝学的ツールとなりました。2 番目の研究は後に発表され、ChR2 が脊椎動物のニューロンの活動を制御する能力があることが確認されました。このときは、ニワトリの脊髄でした。^{[ 21 ]}この研究は、ChR2を光学的サイレンサー（この場合は脊椎動物ロドプシン-4）と共発現させた最初の研究であり、異なる波長で組織を照射することで、これら2つのツールを同時に使用して興奮性細胞を活性化およびサイレンシングできることを初めて実証した。

ChR2が特定のニューロンや筋細胞で発現すると、予測可能な行動を誘発できること、つまり、無傷の動物（この場合は無脊椎動物のC.  elegans）の神経系を制御できることが実証された。^{[ 22 ]}これは、光遺伝学実験で動物の行動を誘導するためにChR2を使用した最初の例であり、遺伝的に指定された細胞型を光学的遠隔制御の対象とした。両方の側面は、その年の初めにGero Miesenböckのグループによって間接的に光ゲートされるイオンチャネルP2X2を使用して実証されていたが、^{[ 23 ]}それ以降、興奮性細胞の遺伝的に標的化された遠隔制御の分野を支配するようになったのは、ケージドリガンドなどの外部化学物質を必要としない直接的な光活性化のパワー、スピード、標的化可能性、使いやすさ、および時間精度のため、チャネルロドプシンなどの微生物オプシンであった。^{[ 24 ]}

ChR2の主な欠点である、単一チャネルのコンダクタンスが小さいこと（特に定常状態）、最適な励起波長が1つ（約470  nm、青色）に限定されていること、および回復時間が比較的長く、20～40 Hzを超えるニューロンの制御された発火ができないことを克服するために、ChR2は遺伝子工学を用いて最適化された。点突然変異H134R（天然タンパク質の134番目の位置にあるアミノ酸ヒスチジンをアルギニンに置換）により定常状態のコンダクタンスが増加したことが、 C.  elegansにおける光遺伝学ツールとしてのChR2の確立も行った2005年の論文で説明されている。^{[ 22 ]} 2009年、Roger Tsienの研究室は、ChR1とChR2のキメラを作成し、特定のアミノ酸を突然変異させることで、ChR2を最適化して定常状態コンダクタンスをさらに増加させ、脱感作を劇的に減少させ、ChEFとChIEFを生成し、最大100  Hzの活動電位列を駆動できるようにした。^{[ 25 ] [ 26 ]} 2010年、HegemannとDeisserothのグループは、天然のChR2にE123T変異を導入し、オンおよびオフの速度論が速いChETAを生成し、最大200 Hzの周波数で個々の活動電位を制御できるようにした （適切な細胞タイプの場合）。^{[ 27 ] [ 25 ]}

ヘーゲマンとダイセロスのグループは、点突然変異C128Sの導入により、結果として得られるChR2誘導体がステップ関数ツールになることも発見した。青色光で「オン」になると、ChR2(C128S)は黄色光でオフになるまで開いた状態を維持する。この変更により時間精度は低下するが、光感度は2桁向上する。^{[ 28 ]}また、多細胞藻類ボルボックス・カルテリでVChR1を発見し、その特性を明らかにした。VChR1は微弱な光電流しか生成しないが、吸収スペクトルはChR2に比べて赤方偏移している。^{[ 29 ]} ChR1配列の一部を使用して、後に光電流振幅が改善され、2つの異なる波長で2つの神経細胞集団を励起できるようになった。^{[ 30 ]}

Deisseroth の研究グループは、生体動物における遺伝子標的リモートコントロール (げっ歯類) ^{[ 31 ]}、げっ歯類における学習の光遺伝学的誘導^{[ 32 ]} 、ラットにおけるパーキンソン病の実験的治療^{[ 33 ] [ 34 ]} 、 fMRIとの組み合わせ(opto-fMRI) ^{[ 35 ]}など、多くの応用を開拓してきました。他の研究室は、全光学的実験のためのChR2 刺激とカルシウムイメージングの組み合わせ^{[ 36 ]} 、長距離^{[ 37 ]}および局所^{[ 38 ]}神経回路のマッピング、トランスジェニック遺伝子座からの ChR2 発現 (直接^{[ 39 ]}または Cre -lox条件付きパラダイム^{[ 38 ]} )、および個々の細胞の活性化を可能にする ChR2 の2 光子励起^{[ 40 ] [ 41 ] [ 42 ]}を開拓してきました。

2013年3月、バンベルク、ボーデン、ダイセロス、ヘーゲマン、ミーゼンベック、ナーゲルは、「光遺伝学の発明と改良」により、ブレイン賞（グレーテ・ルンドベック欧州脳研究賞）を共同受賞した。^{[ 43 ]}同年、ヘーゲマンとナーゲルは、「チャネルロドプシンの発見」によりルイ・ジャンテ医学賞を受賞した。2015年にはボーデンとダイセロスが生命科学分野のブレークスルー賞を受賞し、2020年にはミーゼンベック、ヘーゲマン、ナーゲルが光遺伝学の開発により生命科学・医学分野のショウ賞を受賞した。

チャネルロドプシンは光遺伝学における重要なツールである。チャネルロドプシン-2のC末端は細胞内空間に伸びており、チャネル機能に影響を与えることなく蛍光タンパク質に置き換えることができる。この種の融合構築物は、ChR2を発現する細胞の形態を可視化するのに役立ち、つまり、どの細胞がFPで標識されているかを同時に示し、チャネルロドプシンによって活性を制御できるようにする。^{[ 20 ] [ 36 ]}網膜結合ポケットに近い点変異は、チャネルロドプシンの生物物理学的特性に影響を与え、さまざまな異なるツールをもたらすことが示されている。

チャネルロドプシンは、さまざまなトランスフェクション技術（ウイルス形質導入、エレクトロポレーション、ジーンガン）または遺伝子組み換え動物を用いて、ニューロンなどの興奮性細胞に容易に発現させることができます。光吸収色素であるレチナールは、ほとんどの細胞（脊椎動物）にビタミンAとして存在するため、化学物質を添加することなくニューロンを光刺激することが可能です。チャネルロドプシンが発見される以前は、神経科学者は脳内のニューロンの活動を記録し、この活動と行動を関連付けることしかできませんでした。これは、記録された神経活動が実際にその行動を引き起こしたことを証明するには不十分です。光遺伝学として知られる新興分野である、遺伝子改変細胞のネットワークを光で制御することで、研究者は現在、特定のニューロン群の活動と意思決定などの精神的出来事との因果関係を探求することができます。行動の光制御は、線虫、ショウジョウバエ、ゼブラフィッシュ、マウスで実証されています。^{[ 62 ] [ 63 ]}最近、塩化物イオンを伝導するチャネルロドプシンが人工的に作られ、自然界でも発見されました。^{[ 15 ] [ 58 ]}これらのツールは、シャント阻害によって細胞培養や生体動物のニューロンを不活性化するために使用できます。^{[ 59 ] [ 60 ]}

複数の色の光を使用することで、光遺伝学実験の可能性が広がります。青色光に敏感なChR2と黄色光で活性化される塩化物ポンプであるハロロドプシンを組み合わせることで、神経活動の多色光活性化と抑制が可能になります。^{[ 64 ] [ 65 ]}もう1つの興味深い組み合わせは、青色光に敏感な塩化物チャネルGt ACR2 ^{[ 66 ]}と赤色光に敏感な陽イオンチャネルChrimson ^{[ 67 ]}で、これらは膜電位の双方向制御のために単一のタンパク質（BiPOLES）に組み合わされています。^{[ 68 ]}

蛍光標識したChR2を用いることで、光刺激を受けた軸索やシナプスを識別できる。^{[ 36 ]}これは、シナプス可塑性の誘導中の分子イベントを研究するのに役立つ。^{[ 69 ] [ 70 ]} トランスフェクトされた培養神経ネットワークは、ロボット工学や制御への応用のために、望ましい行動を実行するように刺激することができる。^{[ 71 ]} ChR2は、脳の片側からもう片側への長距離接続をマッピングしたり、個々のニューロンの樹状突起樹上の入力の空間的位置をマッピングするためにも使用されている。^{[ 37 ] [ 72 ]}

2006年には、チャネルロドプシンをトランスフェクションすることで盲目のマウスの視力を回復できることが報告された。^{[ 73 ]}

ニューロンはChRの発現に長期間耐えることができ、いくつかの研究室では医療ニーズを解決するために光遺伝学的刺激をテストしています。盲目のマウスでは、網膜内層細胞にChR2を発現させることで視覚機能が部分的に回復します。^{[ 74 ] [ 75 ]} 2021年には、赤色光感受性ChRであるChrimsonRが網膜変性症（網膜色素変性症）を患うヒト患者の目にウイルス的に送達され、視力の部分的な回復につながりました。^{[ 76 ] [ 77 ]}光学的人工内耳は動物実験でうまく機能することが示されており、現在臨床試験が行われています。^{[ 78 ] [ 79 ] [ 80 ]}将来的には、ChRは、パーキンソン病患者の深部脳刺激や特定のてんかんの制御など、さらに多くの医療用途が見つかるかもしれません。

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