リボザイム

リボザイム（リボ核酸酵素）は、タンパク質酵素の作用と同様に、遺伝子発現におけるRNAスプライシングを含む特定の生化学反応を触媒する能力を持つRNA分子です。1982年のリボザイムの発見は、RNAが（DNAのように）遺伝物質であると同時に（タンパク質のように）生物学的触媒でもあることを示し、 RNAが前生物的な自己複製システムの進化において重要であった可能性を示唆するRNAワールド仮説に貢献しました。^{[ 1 ]}

天然または試験管内で進化したリボザイムの最も一般的な活動は、RNAとDNAの切断または連結、およびペプチド結合の形成です。 ^{[ 2 ]}例えば、既知の最小のリボザイム（GUGGC-3'）は、フェニルアラニル-アデノシン一リン酸の存在下でGCCU-3'配列をアミノアシル化することができます。^{[ 3 ]}リボソーム内では、リボザイムは大きなサブユニットのリボソームRNAの一部として機能し、タンパク質合成中にアミノ酸を連結します。また、 RNAスプライシング、ウイルス複製、およびトランスファーRNA生合成を含むさまざまなRNA処理反応にも関与しています。リボザイムの例としては、ハンマーヘッドリボザイム、VSリボザイム、リードザイム、およびヘアピンリボザイムなどがあります。

RNAワールド仮説を通して生命の起源を研究している研究者たちは、自己複製能力を持つリボザイムの発見に取り組んでおり、そのためには触媒的にRNAポリマーを合成する能力が必要となる。これは、情報劣化を防ぐために高いコピー精度で、生命誕生以前の状況下で起こり得る条件で実現可能であるべきであり、同時に、ダーウィン進化が進むためにコピー過程中に時折エラーが発生することも許容する必要がある。^{[ 4 ]}

リボザイムは、治療薬、特定のRNA配列を切断する酵素、バイオセンサー、機能ゲノミクスや遺伝子発見への応用など、様々な用途で開発されてきた。^{[ 5 ]}

リボザイムが発見される前は、触媒タンパク質としてのみ定義されていた酵素が、唯一知られている生物学的触媒でした。1967年、カール・ウーズ、フランシス・クリック、レスリー・オーゲルは、 RNAが触媒として作用する可能性を初めて示唆しました。この考えは、RNAが複雑な二次構造を形成できるという発見に基づいています。^{[ 6 ]}これらのリボザイムは、RNA転写産物から自身を除去するイントロン内、およびプレtRNAの成熟に関与するRNase P複合体のRNA成分内に見つかりました。1989年、トーマス・R・チェフとシドニー・アルトマンは、「RNAの触媒特性の発見」によりノーベル化学賞を共同受賞しました。 ^{[ 7 ]}リボザイムという用語は、1982年にCell誌に掲載されたケリー・クルーガーらの論文で初めて導入されました。 ^{[ 1 ]}

生物学では、触媒作用はタンパク質にのみ限定されるという考え方が定着していた。しかし、RNA触媒作用の考え方は、生命の起源に関する古くからの疑問、すなわち、細胞の働きをする酵素と、酵素を生成するために必要な情報を運ぶ核酸のどちらが先にできたのか、という疑問に一部起因している。「リボ核酸を触媒として用いる」という概念は、この問題を回避する。本質的に、RNAは鶏と卵の両方になり得る。^{[ 8 ]}

1980年代、コロラド大学ボルダー校のトーマス・チェフは、テトラヒメナ・サーモフィラのリボソームRNA遺伝子におけるイントロンの除去を研究していた。スプライシング反応に関与する酵素を精製しようとしていたところ、細胞抽出液を添加しなくてもイントロンがスプライシングされることを発見した。チェフと彼の同僚は、どれだけ努力しても、スプライシング反応に関与するタンパク質を特定できなかった。多くの研究の後、チェフはRNAのイントロン配列部分がホスホジエステル結合を切断および再形成できると提唱した。ほぼ同時期に、イェール大学のシドニー・アルトマン教授は、細胞内でtRNA分子がどのように処理されるかを研究していたところ、彼と彼の同僚は、前駆体tRNAを活性tRNAに変換するRNase-Pと呼ばれる酵素を単離した。彼らは驚いたことに、RNase-Pにはタンパク質に加えてRNAが含まれており、RNAが活性酵素の必須成分であることを発見した。これは非常に斬新な発想だったため、彼らは研究結果を発表するのに苦労した。翌年、アルトマンは、RNase-P RNAサブユニットがタンパク質成分が存在しない状態でも前駆体tRNAを活性tRNAに切断する触媒作用を示すことで、RNAが触媒として機能できることを実証した。

チェフとアルトマンの発見以来、他の研究者たちは自己切断型RNAや触媒RNA分子の他の例を発見してきた。多くのリボザイムは、ヘアピン型またはハンマーヘッド型の活性中心と、特定の配列で他のRNA分子を切断できる独自の二次構造を持っている。現在では、あらゆるRNA分子を特異的に切断するリボザイムを作ることが可能になっている。これらのRNA触媒は医薬品への応用が期待される。例えば、HIVのRNAを切断するリボザイムが設計されている。もし細胞がこのようなリボザイムを作れば、侵入してくるすべてのウイルス粒子のRNAゲノムがリボザイムによって切断され、感染を防ぐことができるだろう。

タンパク質には20種類のアミノ酸側鎖があるのに対し、リボザイムはモノマー単位（ヌクレオチド）ごとに4種類の選択肢しかないにもかかわらず、多様な構造とメカニズムを持っています。多くの場合、リボザイムは対応するタンパク質のメカニズムを模倣することができます。たとえば、自己切断型リボザイムRNAでは、2'ヒドロキシル基を求核剤として用いて架橋リン酸を攻撃し、N+1塩基の5'酸素を脱離基として作用させるインラインSN2反応が行われます。これに対し、同じ反応を触媒するタンパク質であるRNase Aは、配位ヒスチジンとリジンを塩基として用いてリン酸骨格を攻撃します。^{[ 2 ]}

多くのタンパク質酵素と同様に、金属結合は多くのリボザイムの機能にとっても重要である。^{[ 9 ]}これらの相互作用は、リン酸骨格とヌクレオチドの塩基の両方を使用することが多く、劇的な構造変化を引き起こす。^{[ 10 ]}金属の存在下でのホスホジエステル骨格の切断には、2 つのメカニズムクラスがある。最初のメカニズムでは、内部の 2'-OH 基が SN ₂メカニズムでリン中心を攻撃する。金属イオンは、まずリン酸酸素を配位し、次にオキシアニオンを安定化させることで、この反応を促進する。2 番目のメカニズムも SN _{2置換に従うが、求核剤は RNA 自体ではなく、水または外因性ヒドロキシル基から来る。最小のリボザイムは UUU であり、Mn} ²⁺の存在下で最初のメカニズムを介して GAAA テトラヌクレオチドの G と A の間の切断を促進することができる。このトリヌクレオチド（相補的なテトラマーではなく）がこの反応を触媒する理由は、UUU-AAAペアリングが64のコンフォメーションの中で最も弱く、最も柔軟なトリヌクレオチドであり、Mn ²⁺の結合部位を提供するためであると考えられる。^{[ 11 ]}

リン酸基転移は金属イオンなしでも触媒されることがある。例えば、膵臓リボヌクレアーゼAやB型肝炎デルタウイルス（HDV）リボザイムは、金属イオンなしで酸塩基触媒作用によってRNA骨格の切断を触媒することができる。^{[ 12 ] [ 13 ]}ヘアピンリボザイムも金属イオンなしでRNAの自己切断を触媒することができるが、そのメカニズムはまだ不明である。^{[ 13 ]}

リボザイムは、活性化エントロピーを低下させることにより、隣接するアミノ酸間のペプチド結合の形成を触媒することもできる。^{[ 12 ]}

リボザイムはほとんどの細胞では非常にまれですが、その役割は生命にとって不可欠な場合もあります。たとえば、RNAをタンパク質に翻訳する生物学的機械であるリボソームの機能部分は、基本的にリボザイムであり、補因子としてMg ²⁺などの金属イオンに配位することが多いRNA三次構造モチーフで構成されています。^{[ 14 ]}モデル系では、 C3リボザイムを切り詰めて作られた触媒/基質で、触媒と相補的な3塩基対を持つ4ヌクレオチド基質のトランスフェニルアラニン化を触媒する5ヌクレオチドRNAには、二価カチオンは不要です。^{[ 15 ]}

最もよく研​​究されているリボザイムは、おそらく、Cech ^{[ 16 ]}と Altman ^{[ 17 ]}による最初の発見のように、自身または他の RNA を切断するものだろう。しかし、リボザイムはさまざまな反応を触媒するように設計することも^{[ 18 ]}、自然にそれらの反応を触媒することもある。これらの活動には次のようなものがある。^{[ 19 ]}

• RNAエンドヌクレアーゼ
• ヌクレオチジルトランスフェラーゼ
• ホスホトランスフェラーゼ
• ホスファターゼ
• リガーゼ
• キナーゼ
• グルカノトランスフェラーゼ

RNAは、シャペロニンと同様の方法で、プリオンの病理的なタンパク質構造の折り畳みを触媒する可能性がある。^{[ 20 ]}

RNAは遺伝分子としても機能することができ、このことからウォルター・ギルバートは、遠い昔、細胞は今日のようにDNAとタンパク質の間でこれらの機能を分けるのではなく、RNAを遺伝物質と構造分子および触媒分子の両方として使用していたと提唱しました。この仮説は、生命の起源に関する「RNAワールド仮説」として知られています。^{[ 21 ]}ヌクレオチドとRNA（したがってリボザイム）は無機化学物質から生じる可能性があるため、これらは最初の酵素、そして実際には最初の「複製子」（つまり、自己複製する情報を含む高分子）の候補です。2002年に、2つの基質を連結して自身の正確なコピーを生成する自己複製リボザイムの例が記述されました。^{[ 22 ]} RNAの触媒活性の発見は、生命の起源の「鶏と卵」のパラドックスを解決し、ペプチドと核酸の起源のセントラルドグマの問題を解決しました。このシナリオによれば、生命の起源においては、すべての酵素活性と遺伝情報の符号化は、RNAという一つの分子によって行われていた。

リボザイムは、特定の条件下で活性化モノマーから他のRNA分子の合成を触媒できる分子として実験室で生産されており、これらの分子はRNAポリメラーゼリボザイムとして知られています。^{[ 23 ]}最初のRNAポリメラーゼリボザイムは1996年に報告され、長さ6ヌクレオチドまでのRNAポリマーを合成することができました。^{[ 24 ]}ランダムRNA配列の大きなプールからRNAリガーゼリボザイムに対して変異誘発と選択が行われ、^{[ 25 ]} 2001年に改良された「ラウンド18」ポリメラーゼリボザイムが単離され、長さ14ヌクレオチドまでのRNAポリマーを触媒できるようになりました。^{[ 26 ]}ラウンド18リボザイムにさらに選択を適用したところ、B6.61リボザイムが生成され、24時間以内にプライマーテンプレートに最大20ヌクレオチドを追加することができ、その後、ホスホジエステル結合の切断によって分解した。^{[ 27 ]}

リボザイムがRNA配列を重合できる速度は、ミセル内で起こると大幅に倍増する。^{[ 28 ]}

次に発見されたリボザイムは「tC19Z」リボザイムで、0.0083変異/ヌクレオチドの忠実度で最大95ヌクレオチドを追加できます。 ^{[ 29 ]}次に、研究者によって「tC9Y」リボザイムが発見され、零下温度の共晶相条件下で最大206ヌクレオチド長のRNA鎖を合成することができました。^{[ 30 ]}この条件は、以前にリボザイムポリメラーゼ活性を促進することが示されています。^{[ 31 ]}

tC9-4Mと呼ばれるRNAポリメラーゼリボザイム（RPR）は、生理的レベルに近いマグネシウムイオン濃度で、自身よりも長いRNA鎖（つまり177ヌクレオチドより長い鎖）を重合することができたが、以前のRPRは、生命誕生以前にはあり得ない最大200 mMの濃度を必要とした。これを実現するために必要だった唯一の因子は、リジンデカペプチドと呼ばれる非常に単純なアミノ酸ポリマーの存在であった。^{[ 32 ]}

当時合成された最も複雑な RPR は 24-3 と呼ばれ、これは、これまでリボザイムではアクセスできなかった RNA 基質の複雑な二次構造を通り抜け、多様なヌクレオチド配列の配列を重合できるようになった。実際、この実験は、リボザイムを使用して tRNA 分子を合成した最初の実験であった。^{[ 33 ] Tjhung らは[ 34 ]} 24-3 リボザイムから始めて、さらに 14 ラウンドの選択を適用し、複雑な RNA 分子をコピーする前例のないレベルの活性を持つ、 in vitro進化による RNA ポリメラーゼ リボザイム「38-6」を得た。しかし、このリボザイムは自己をコピーできず、その RNA 産物は高い突然変異率を示す。その後の研究では、研究者らは38-6リボザイムから始め、さらに14回の選択ラウンドを適用して「52-2」リボザイムを生成した。これは38-6と比較して再び何倍も活性が高く、検出可能な機能レベルのクラスIリガーゼを生成し始めることができたが、T7 RNAポリメラーゼなどのタンパク質による同じテンプレートのコピーと比較すると、忠実度と機能にはまだ限界があった。^{[ 35 ]}

t5(+1)と呼ばれるRPRは、一度に1つのヌクレオチドではなく、一度に3つのヌクレオチドを追加します。このヘテロ二量体RPRは、ヘアピンを含む24-3ではアクセスできない二次構造をナビゲートできます。Z RPRとして知られる以前に合成されたRPRからのみ派生したRNA変異体の初期プールでは、2つの配列が別々に出現し、互いに相互依存するように進化しました。タイプ1 RNAは触媒活性を失いましたが、タイプ5 RNAと複合体を形成することで重合能力が向上し、RNAテンプレート基質との分子間相互作用が可能になり、以前の研究の制限であったテンプレートをRPRのRNA配列に直接テザーする必要がなくなりました。t5(+1)はテンプレートにテザーする必要がないだけでなく、t5(+1)は3' → 5'方向と5' 3 → 3'方向の両方でテンプレートを重合する能力があったため、プライマーも必要ありませんでした。^{[ 36 ]}

高度に進化したRNAポリメラーゼリボザイムは逆転写酵素として機能することができ、つまりRNAテンプレートを使用してDNAコピーを合成することができた。^{[ 37 ]}このような活性は、地球上の生命の初期の歴史においてRNAゲノムからDNAゲノムへの移行に不可欠であったと考えられている。逆転写能力は、初期のRNA依存性RNAポリメラーゼリボザイムの二次的な機能として生じた可能性がある。

リボザイムに折り畳まれるRNA配列は、二本鎖RNAに侵入し、開いたホロポリメラーゼ複合体に再構成され、特定のRNAプロモーター配列を探索し、認識すると再び再構成されて、配列の相補鎖を重合するプロセス型になることができる。このリボザイムは、二本鎖RNAを最大107ヌクレオチドまで伸長することができ、重合される配列をテザーする必要なくこれを行う。^{[ 38 ]}

20ヌクレオチドの短いRNA変異リボザイムが同定され、これは2つの10ヌクレオチドオリゴマーのテンプレート指向ライゲーションによって自己複製する。^{[ 39 ]}この最小限のRNA自己複製はランダムなオリゴマーのプールで発見され、原始的な構成要素からRNAベースの遺伝システムが出現する初期段階を表している可能性がある。^{[ 39 ]}

DNA細胞生命体より前のRNAワールドでは、有性生殖が存在していた可能性がある。 ^{[ 40 ]} 必須RNAリボザイム分子の単一コピーを持つゲノムを持つ初期の細胞生命体は、必須リボザイムの複製を阻害し細胞死を引き起こす可能性のある環境ダメージ条件に対して脆弱であったと考えられる。そのような損傷を受けた2つの初期細胞が融合（有性相互作用）することで、損傷を受けていないRNAセグメントの組み合わせが結合し、機能的なゲノムの形成が促進され、細胞の生存と生殖能力が可能になる。

生物に存在するリボザイムが発見されて以来、実験室で作られた新しい合成リボザイムの研究に関心が寄せられてきた。例えば、優れた酵素活性を持つ人工的に作られた自己切断RNAが作られている。TangとBreaker ^{[ 41 ]は、}ランダム配列RNA由来のRNAをin vitroで選択することにより、自己切断RNAを単離した。作られた合成リボザイムの中には、新規構造を持つものもあれば、天然に存在するハンマーヘッドリボザイムに類似したものもあった。

2015年、ノースウェスタン大学とイリノイ大学シカゴ校の研究者らは、細胞内のすべてのタンパク質と酵素を生成する本物の細胞成分とほぼ同等に機能するテザー型リボソームを設計した。リボソームT、またはRibo-Tと呼ばれるこの人工リボソームは、マイケル・ジュエットとアレクサンダー・マンキンによって作成された。^{[ 42 ]}人工リボザイムを作成するために使用される技術には、指向性進化が含まれる。このアプローチは、RNAが触媒と情報ポリマーの両方としての二重の性質を利用しており、研究者がポリメラーゼ酵素を使用してRNA触媒の膨大な集団を簡単に作成できる。リボザイムは、逆転写酵素を使用してさまざまなcDNAに逆転写し、エラーを起こしやすいPCRで増幅することによって変異する。これらの実験の選択パラメーターはしばしば異なる。リガーゼリボザイムを選択するアプローチの1つは、基質に共有結合したビオチンタグを使用することである。分子が目的とするリガーゼ活性を有する場合、ストレプトアビジンマトリックスを用いて活性分子を回収することができる。

リンカーンとジョイスは、試験管内進化を利用して、事前に合成された高度に相補的なオリゴヌクレオチドの結合により、約1時間で自己複製可能なリボザイムリガーゼを開発した。^{[ 43 ]}

真の触媒ではないものの、アプタザイムと呼ばれる人工自己切断リボスイッチの作成も活発な研究分野となっている。リボスイッチは、翻訳を調節するために低分子リガンドに応答して構造を変化させる調節RNAモチーフである。幅広い代謝物やその他の低分子有機分子に結合する多くの既知の天然リボスイッチがある一方で、リボスイッチに基づくリボザイムはglmSのみ記述されている。^{[ 44 ]}自己切断リボスイッチの特性評価に関する初期の研究は、リガンドとしてテオフィリンを使用することに焦点を当てていた。これらの研究では、リボソーム結合部位をブロックするRNAヘアピンが形成され、それによって翻訳が阻害される。リガンド（これらの場合はテオフィリン）が存在すると、調節RNA領域が切断され、リボソームが標的遺伝子に結合して翻訳できるようになる。このRNAエンジニアリング研究の多くは、上記の例のような指向性進化ではなく、合理的な設計と以前に決定されたRNA構造に基づいていた。最近の研究では、リボザイムリボスイッチで使用されるリガンドがチミンピロリン酸を含むように拡大されている。蛍光活性化細胞選別もアプタザイムの設計に使用されている。^{[ 45 ]}

リボザイムは、遺伝子治療による疾患治療のために提案され、開発されてきた。RNAベースの酵素を治療薬として使用する際の大きな課題の一つは、体内における触媒RNA分子の半減期が短いことである。この課題に対処するため、リボースの2'位を修飾してRNAの安定性を向上させる。リボザイム遺伝子治療の分野の一つとして、RNAウイルスの阻害が挙げられる。

HIV RNAを標的とする合成リボザイムの一種である遺伝子剪刀が開発され、HIV感染症の臨床試験に入っている。^{[ 46 ] [ 47 ]}

同様に、リボザイムは、 C型肝炎ウイルスRNA、SARSコロナウイルス（SARS-CoV）^{[ 48 ]} 、アデノウイルス^{[ 48 ]}、インフルエンザAおよびBウイルスRNAを標的とするように設計されている。^{[ 49 ] [ 50 ] [ 51 ] [ 48 ]}リボザイムは、ウイルスのゲノムの保存領域を切断することができ、哺乳類細胞培養でウイルスを減少させることが示されている。^{[ 52 ]}研究者によるこれらの努力にもかかわらず、これらのプロジェクトは前臨床段階にとどまっている。

十分に検証された天然由来のリボザイムクラス：

• トム・チェフ氏によるショートトーク：「リボザイムの発見」