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| 肝炎デルタウイルスリボザイム | |
|---|---|
 | |
| 識別子 | |
| シンボル | HDV_リボザイム |
| Rfam | RF00094 |
| その他のデータ | |
| RNAタイプ | 遺伝子;リボザイム |
| ドメイン | ウイルス |
| それで | 0000374 ... |
| PDB構造 | PDBe |
肝炎デルタウイルス（HDV）リボザイムは、肝炎デルタウイルスに見られる非コードRNAで、ウイルスの複製に必要です。肝炎デルタウイルスは、リボザイム活性を利用して宿主に感染する唯一の既知のヒトウイルスです。[1]リボザイムは、肝炎デルタウイルスの複製中に自己切断反応でRNA転写物を単位長さに処理する働きをし、二重ローリングサークル機構によって増殖すると考えられています。[2] [3]リボザイムは、タンパク質因子が存在しない状態でも生体内で活性であり、発見当時は最も速く知られている天然の自己切断RNAでした。[4]
このリボザイムの結晶構造はX線結晶構造解析によって解明されており、二重擬似結び目によってつながれた5つのらせんセグメントが示されている。[1]
センス（ゲノムバージョン）に加えて、すべてのHDVウイルスにはHDVリボザイムのアンチゲノムバージョンもあります。 [5]このバージョンは、正確な相補配列ではありませんが、センス（ゲノム）鎖と同じ構造を採用しています。 2つの間の唯一の「重要な」違いは、P4ステムの小さな膨らみと、より短いJ4/2ジャンクションです。 ゲノムリボザイムとアンチゲノムリボザイムの両方が複製に必要です。[2]
HDV様リボザイム
HDVリボザイムは、他の多くの自己切断型リボザイムと構造的および生化学的に関連している。これらの他のリボザイムは、デルタ肝炎ウイルスには見られないにもかかわらず、類似性があるため、HDVリボザイムの例と呼ばれることが多い。この事実を示すために、「HDV様」と呼ばれることもある。[6]
HDV様リボザイムには、哺乳類のCPEB3リボザイム、バクテリオファージのシータリボザイム、レトロトランスポゾンのメンバー（例えば、昆虫のR2 RNAエレメント、トリパノソーマ類のL1Tcおよびおそらく他のレトロトランスポゾン）、および細菌の配列が含まれる。[7] [8] [6] [9] [10] [11]この分類はおそらく収斂進化の結果である。 ヒト以外で発見されたデルタウイルスもDVリボザイムを有しており、提案されている水平遺伝子伝播のシナリオではまだこれを説明できない。[12] [13] [14]
触媒のメカニズム
HDV リボザイムは、基質ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドとリボザイムの 5'-ヒドロキシルとの間のホスホジエステル結合の切断を触媒する。デルタ肝炎ウイルスでは、この基質ヌクレオチド配列はウリジンで始まり、U(-1) として知られているが、-1 ヌクレオチドの同一性は触媒速度を大きく変化させない。[1]化学的性質にのみ要件があり、Perrotta と Been によって示されているように、U(-1) リボースをデオキシリボースに置換すると反応が消失し、これは 2'-ヒドロキシルが化学反応における求核剤であるという予測と一致する。[15]したがって、ハンマーヘッド リボザイムなどの他の多くのリボザイムとは異なり、HDV リボザイムは触媒の上流要件がなく、効率的に反応するために基質として単一の -1 リボヌクレオチドのみを必要とする。[1]
当初、リボザイムの75番目のヌクレオチドであるC75として知られるシトシンは、C75のN3がU(-1)ヌクレオチドの2'-ヒドロキシルからプロトンを抽出してリン酸ジエステル結合への求核攻撃を促進することで、一般的な塩基として作用できると考えられていました。[1]しかし、C75のN3のpKaが通常の値4.45から変化し、約6.15または6.40に近いことはよく知られていますが、[16] [17]一般的な塩基触媒として機能するほど中性ではありません。代わりに、C75のN3は、リボザイムの離脱した5'-ヒドロキシルを安定化するルイス酸として作用すると考えられています。これは、結晶構造において5'-ヒドロキシルに近いことから裏付けられています。[1] [18] C75ヌクレオチドを他のヌクレオチドに置換するとリボザイムの活性が失われるか、大幅に損なわれるが、この活性はイミダゾールで部分的に回復することができ、C75が触媒活性に関与していることがさらに示唆される。[19]
HDVリボザイムのC75は、その特異なpKaのため、いくつかの研究の対象となってきた。遊離ヌクレオシドの典型的なpKa値は約3.5から4.2である。これらの低いpKa値は酸性であり、塩基性になる可能性は低い。しかし、溶媒和されていない活性部位の裂け目を含むリボザイム内の構造環境は、負の静電ポテンシャルを提供し、それがシトシンのpKaを乱してルイス酸として作用するのに十分なほどである可能性がある。[20] [21] [22] [23]
ルイス酸による 5'-ヒドロキシル脱離基の安定化に加えて、HDV リボザイムは金属イオンを使用して 2'-ヒドロキシルを活性化し、U(-1) ヌクレオチドを攻撃できることも現在では認められています。リボザイムの活性部位にあるマグネシウムイオンは、2'-ヒドロキシル求核剤と切断可能なリン酸の酸素に配位し、ルイス酸として作用して 2'-ヒドロキシルを活性化する可能性があります。[19] [18]さらに、U23 のリン酸がルイス酸として作用して、マグネシウムが配位イオンとして機能し、2'-ヒドロキシルからプロトンを受け取る可能性があります。[24] HDV リボザイムは活性を示すために金属イオンを必要としないため、必須の金属酵素ではありませんが、活性部位にマグネシウムが存在すると切断反応が大幅に改善されます。 HDVリボザイムは、折り畳むために少量の二価カチオンを非特異的に必要とするようで、Mg 2+、Ca 2+、Mn 2+、およびSr 2+で活性である。[1]金属イオンが存在しない場合は、水がルイス酸としてのマグネシウムの役割を代替できる可能性があると思われる。
上流RNAによる制御
HDVリボザイムの急速な自己切断特性により制限されるため、これまでのリボヌクレアーゼ実験は前駆体ではなく自己切断の3'産物に対して行われていた。[25]しかし、隣接配列はHDVリボザイムの自己切断活性の調節に関与することが知られている。[26] [27] [28]そのため、自己切断部位の5'上流配列が組み込まれ、HDVリボザイムの結果として生じる自己切断活性を研究するようになった。[26] 2つの代替構造が特定されている。
最初の阻害構造は、切断部位の上流 30 nt から 3' 末端の下流 15 nt まで広がる延長された転写産物 (つまり -30/99 転写産物、座標は自己切断部位に対して参照される) によって折り畳まれている。[26]隣接配列は転写中にリボザイムを運動学的トラップに隔離し、自己切断速度を極端に低下させる。[26]この自己切断防止構造には、活性コンフォメーションを破壊する 3 つの代替ステム、Alt1、Alt2、および Alt3 が含まれる。Alt1 は、阻害上流ストレッチ (-25/-15 nt) と下流ストレッチ (76/86 nt) によって形成される 10 bp の長距離相互作用である。[26] Alt1は活性構造のステムP2を破壊し、P2はゲノムリボザイムとアンチゲノムリボザイムの両方を活性化する役割を持つと提案されている。[26] [29] [30] Alt2は上流の隣接配列とリボザイムとの相互作用であり、Alt3は非ネイティブなリボザイム-リボザイム相互作用である。[26]
この阻害性コンフォメーションの二次構造は、さまざまな実験的アプローチによって裏付けられています。[26]まず、リボヌクレアーゼによる直接プローブを実施し、プローブ結果からの制約を使用して mfold 3.0 によるモデリングを行ったところ、提案された構造と一致しました。[26]次に、AS1/2 のさまざまな領域に相補的な一連の DNA オリゴマーを使用してリボザイム活性を回復しました。その結果、AS1/2 の阻害役割が確認されました。[26] 3 番目に、変異解析によりリボザイムの外側に単一/二重変異を導入し、観察されたリボザイム活性が Alt1 の安定性と直接関連していることを確認しました。[26] AS1 の安定性は、自己切断活性と逆相関していることがわかりました。[26]
2番目の許容構造は、HDVリボザイムが共転写的に自己切断することを可能にし、この構造にはさらにRNA転写物の-54/-18 nt部分が含まれます。[26]前述の阻害性コンフォメーションからの上流阻害性-24/-15ストレッチは、切断部位の上流に位置するヘアピンP(-1)に隔離されています。[26] [31] [32]しかし、P(-1)モチーフはゲノム配列にのみ見られ、これはゲノムHDV RNAコピーが感染した肝細胞でより豊富であるという現象と相関している可能性があります。[26] [5]実験的証拠もこの代替構造を支持しています。まず、リボヌクレアーゼによる構造マッピングは、この構造の高速切断特性のために、前駆体転写産物全体ではなく-54/-1断片をプローブするために使用されます。この構造は、ローカルヘアピンP(-1)（-54/-40と-18/-30 ntの間）と一致します。[26]次に、21のゲノムHDV RNA分離株間で、P(-1)とP(-1)とP1の間のリンク領域に進化的保存性が見られます。[26]
RNA転写産物の調製における使用
HDV リボザイムの切断反応の特殊な性質により、同質の 3' 末端を持つ RNA 転写産物を調製するための便利なツールとなり、しばしば不均質末端や望ましくない付加を生じる T7 RNA ポリメラーゼによる RNA 転写の代替手段となります。リボザイムの cDNA バージョンは、標的 RNA 配列の cDNA および T7 RNA ポリメラーゼによる転写から調製された RNA に隣接して調製できます。-1 ヌクレオチドは不変であるため、リボザイム配列は下流の要件なしに効率的に切断され、ホスファターゼまたは T4 ポリヌクレオチド キナーゼによる処理で簡単に除去できる 2'-3' 環状リン酸が残ります。[33]次に、標的 RNA をゲル精製で精製できます。
参考文献
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外部リンク
- Rfamの肝炎デルタウイルスリボザイムのページ
- HDVリボザイムのサブウイルスRNAデータベースエントリ