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比較ゲノムハイブリダイゼーション（CGH）は、細胞培養を必要とせずに、参照サンプルと比較してテストサンプルのDNAの倍数性レベルに対するコピー数変異（CNV）を分析する分子細胞遺伝学的手法です。この技術の目的は、2つのソースから得られた2つのゲノムDNAサンプルを迅速かつ効率的に比較することです。これらのソースは、全染色体またはサブ染色体領域（全染色体の一部）のゲインまたはロスに関して差異が含まれていると疑われるため、多くの場合密接に関連しています。この技術は、もともと固形腫瘍と正常組織の染色体構成の差異を評価するために開発され、[ 1 ] 、使用する顕微鏡の解像度によって制限されるギムザ染色や蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）などの従来型の細胞遺伝学的分析技術と比較して、5～10メガベースという改善された解像度を備えています。[ 2 ] [ 3 ]
これは、競合蛍光in situハイブリダイゼーションを用いることで実現されます。簡単に言うと、この方法では、比較対象となる2つのサンプル（一般的には試験サンプルと参照サンプル）からDNAを分離し、それぞれのDNAサンプルを異なる色（通常は赤と緑）の蛍光色素（蛍光分子）で個別に標識し、 DNAを変性させて一本鎖にし、得られた2つのサンプルを1：1の比率で通常の染色体中期染色体標本にハイブリダイゼーションさせます。標識されたDNAサンプルは、それぞれの由来部位で染色体標本に結合します。蛍光顕微鏡とコンピュータソフトウェアを用いて、異なる色の蛍光シグナルを各染色体の長さに沿って比較し、2つのサンプル間の染色体の違いを特定します。染色体の特定領域における試験サンプルの色の強度が高いほど、対応するサンプルにおいてその領域の物質が増加していることを示し、参照サンプルの色の強度が高いほど、試験サンプルにおいてその特定領域の物質が減少していることを示します。中性色（蛍光色素のラベルが赤と緑の場合は黄色）は、その場所では2つのサンプル間に違いがないことを示しています。[ 2 ] [ 3 ]
CGHは不均衡な染色体異常のみを検出できます。これは、相互転座、逆位、環状染色体などの均衡な染色体異常は、CGH技術で検出されるコピー数に影響を与えないためです。しかし、CGHは1回の検査で46本のヒト染色体すべてを探索し、顕微鏡レベルでの欠失や重複を発見できるため、他の細胞学的技術でさらに調査すべき候補遺伝子の特定につながる可能性があります。[ 2 ]
DNAマイクロアレイとCGH技術を組み合わせることで、より特異的なアレイCGH（aCGH）が開発され、100キロベースという低解像度で遺伝子座ごとのCNV測定が可能になった。[ 4 ] [ 5 ]この改良された技術により、既知および未知の疾患の病因が発見される。
CGHの開発の動機は、当時利用可能だった細胞遺伝学的分析法（ギムザ染色法とFISH法）が、結果の解釈に必要な顕微鏡によって解像度が制限されていたという事実から生じた。さらに、ギムザ染色法の 解釈は曖昧になる可能性があり、信頼性が低下していた。また、どちらの手法も多くの労力を必要とするため、検査できる遺伝子座が制限されていた。 [ 4 ]
CGH解析の最初の報告は、1992年にカリフォルニア大学サンフランシスコ校のKallioniemiらが固形腫瘍の解析にCGHを利用したものです。彼らは、乳がん細胞株と原発性膀胱腫瘍の両方にこの技術を直接適用して、細胞の完全なコピー数核型を確立することでこれを実現しました。彼らは16の異なる増幅領域を特定することができ、その多くは新しい発見でした。[ 1 ]
その後間もなく、1993年にデュ・マノワールらはほぼ同じ方法論を報告した。著者らは、DNAライブラリーから一連のヒト染色体を2種類の異なる蛍光色素で異なる比率で染色してこの技術をテストし、ダウン症候群またはT細胞前リンパ球性白血病の患者および腎乳頭癌細胞株のゲノムDNAにもCGHを適用した。得られた蛍光比は正確であり、異なる細胞型のゲノムDNA間の違いが検出可能であることから、CGHは非常に有用な細胞遺伝学的解析ツールであると結論付けられた。[ 6 ]
当初、CGH技術の普及は困難でした。プロトコルが統一されておらず、特にデータの解釈の不確実性から矛盾が生じたためです。[ 3 ]しかし、1994年に、理解しやすいプロトコルを詳細に説明したレビューが発表され[ 7 ]、画像解析ソフトウェアが市販されるようになったことで、CGHは世界中で利用できるようになりました。[ 3 ]マイクロダイセクションや縮重オリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（DOP-PCR） などの新しい技術がDNA産物の生成に利用可能になったことで、CGHの概念をより小さな染色体異常に適用することが可能になり、CGHの解像度が向上しました。[ 3 ]
アレイCGHの実装は、従来の染色体中期標本調製の代わりにDNAマイクロアレイを使用するもので、1997年にSolinas-Tolodoらが腫瘍細胞を用いて先駆的に行い[ 8 ]、1998年にはPinkelらが乳がん細胞を用いて行った[ 9 ] 。これは、ヒトゲノム全体にわたって既知の位置を持つクローン化DNA断片のライブラリを作成したヒトゲノムプロジェクトによって可能になったもので、これらの断片はDNAマイクロアレイ上のプローブとして使用される[ 10 ] 。現在では、cDNA、ゲノムPCR産物、細菌人工染色体（BAC）など、さまざまな由来のプローブを、最大200万個のプローブを含むDNAマイクロアレイで使用できる。[ 10 ]アレイCGHは自動化されており、プローブが中期染色体標本よりもはるかに小さいため、従来のCGHよりも高い解像度（100 kbまで）が可能で、必要なDNA量が少なく、必要に応じて特定の染色体領域を標的にすることができ、注文済みであるため分析が速く、診断用途にはるかに適応しやすい。[ 10 ] [ 11 ]
スライド上のDNAは参照サンプルであり、核型が正常な男性または女性から得られたものですが、女性のDNAを使用する方が望ましいです。女性は男性のY染色体よりもはるかに多くの遺伝情報を含む2つのX染色体を持っているためです。フィトヘマグルチニンで刺激した末梢血リンパ球を使用します。ヘパリン処理した血液1mLを培養培地10mlに加え、 5% CO 2 雰囲気下で37℃で72時間培養します。コルヒチンを加えて細胞を分裂期で停止させ、細胞を回収して低張性塩化カリウムで処理し、3:1メタノール/酢酸で固定します。[ 3 ]
次に、細胞懸濁液を約 30 cm の距離からエタノールで洗浄したスライドに 1 滴下します。 これは、室温、湿度 60～70% で行うのが最適です。スライドは位相差顕微鏡で観察して評価し、細胞質は最小限に抑え、染色体は重なり合わず、分離した染色分体がなく、長さ 400～550 バンドで、最後に光沢ではなく暗く見えるようにします。スライドは室温で一晩風乾し、その後は、乾燥状態を維持するためにシリカビーズまたは窒素が 存在する状態で、-20 °Cで 4 枚ずつグループにして保管する必要があります。ハイブリダイゼーションは変動する可能性があるため、異なるドナーをテストする必要があります。市販のスライドを使用することもできますが、必ず最初にテストする必要があります。[ 3 ]
標準的なフェノール抽出法は、試験組織または参照組織（核型的に正常な個体）からDNAを取得するために使用され、トリス-エチレンジアミン四酢酸とフェノールを等量の水性DNAと混合します 。続いて、撹拌と遠心分離によって分離し、その後、水層を除去してエーテルでさらに処理し、最後にエタノール沈殿を使用してDNAを濃縮します。[ 3 ]
市販のDNA分離キット（アフィニティーカラムに基づく）を使用して完了できる。[ 3 ]
DNAは、新鮮または凍結組織から抽出するのが最も高品質であるため望ましいが、適切な手順に従えば、ホルマリン固定またはパラフィン 包埋された保存材料を使用することも可能になっている。CGH実験には0.5～1μgのDNAで十分であるが、必要な量が得られない場合は、DOP-PCRを用いてDNAを増幅することができる。ただし、この場合は、信頼性を向上させるために、テストDNAサンプルと参照DNAサンプルの両方にDOP-PCRを適用する必要がある。[ 3 ]
ニックトランスレーションはDNAの標識に使用され、DNAを切断し、蛍光色素（直接標識）またはビオチンやオキシゲニンで標識されたヌクレオチドを置換して、後で蛍光色素結合抗体を付加する（間接標識）という手順が含まれます。最適なハイブリダイゼーションのためには、テストDNAと参照DNAの両方の断片長が500kb～1500kbの範囲内である必要があるため、ゲル電気泳動によって断片長を確認することが重要です。[ 3 ]
ラベルなしのライフテクノロジーズ社のCot-1 DNA（長さ50bp～100bpの反復配列が豊富な胎盤DNA）は、特にセントロメアとテロメアにある通常の反復DNA配列をブロックするために添加されます。これらの配列が検出されると、蛍光比が低下し、ゲインやロスが検出されなくなる可能性があるためです。[ 3 ]
標識された試験用DNAと標識された参照用DNAをそれぞれ8～12μlずつ混合し、40μg のCot-1 DNAを添加して沈殿させ、その後、6μlのハイブリダイゼーション混合液に溶解する。この混合液は、DNAの融解温度を下げるために50%ホルムアミド、有効プローブ濃度を上げるために10%デキストラン硫酸を含む、pH7.0の生理食塩水クエン酸ナトリウム（SSC）溶液である。[ 3 ]
スライドとプローブの変性は別々に行われる。スライドは72 ℃で5～10分間70%ホルムアミド/2xSSCに浸漬し、プローブは80℃のウォーターバスに10分間浸漬して変性させ、直ちに中期スライド標本に加える。この反応はカバースリップで覆い、40 ℃ の湿潤チャンバーで2～4日間放置する。 [ 3 ]
次にカバーガラスを取り外し、室温で2xSSCを用いて5分間の洗浄を3回、45 ℃で0.1xSSCを用いて1回、室温でTNTを用いて1回行う。反応液を10分間プレインキュベートした後、37 ℃で60分間インキュベートし、TNTを用いてさらに5分間の洗浄を3回、室温で2xSSCを用いて1回行う。スライドを70%/96%/100%のエタノール系列で乾燥させ、染色体識別のためにDAPI（0.35 μg/ml）で対比染色し、カバーガラスで封入する。[ 3 ]
観察には、 DAPI染色液と使用する2種類の蛍光色素に適したフィルターを備えた蛍光顕微鏡が必要であり、これらのフィルターは狭帯域通過フィルターのように蛍光色素間のクロストークを最小限に抑えるものでなければならない。顕微鏡は、色収差のない均一な照明を提供し、適切に調整され、アポクロマートで63倍または100倍の倍率が得られる「平面」タイプの対物レンズを備えている必要がある。 [ 3 ]
画像は、試料レベルで少なくとも 0.1 μm の空間分解能を持つカメラを使用して記録し 、少なくとも 600x600 ピクセルの画像を得る必要があります。カメラはまた、少なくとも 5 ～ 10 秒間画像を積分でき、最低 8 ビットの測光解像度を備えている必要があります。[ 3 ]
画像処理ステップには専用の CGH ソフトウェアが市販されており、背景ノイズの除去、染色体由来ではない物質の除去とセグメント化、蛍光比の正規化 、対話型核型分析の実行、染色体の標準長へのスケーリングに必要となる。「相対コピー数核型」は、多数の高品質の中期染色体の比率を平均し、バンドパターンに基づいて染色体を識別する図であるイデオグラムに沿ってプロットすることによって生成され、染色体の欠失または増幅領域を示す。比率プロファイルの解釈は、固定閾値または統計的閾値 (信頼区間) を使用して行われる。信頼区間を使用する場合、蛍光比の 95% に 1.0 が含まれない場合に、ゲインまたはロスが特定される。[ 3 ]
DNA を含むすべてのステップ、特にテスト DNA の汚染を避けるために細心の注意を払う必要があります。サンプルに正常 DNA が混入すると結果が 1.0 に近づき、異常が見逃される可能性があります。FISH、PCR 、フローサイトメトリー実験を使用して結果を確認できます。[ 4 ] [ 12 ]
アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（マイクロアレイベース比較ゲノムハイブリダイゼーション、マトリックスCGH、アレイCGH、aCGHとも呼ばれる）は、ゲノム全体にわたる高解像度スケールで染色体コピー数の変化を検出するための分子細胞遺伝学的技術である。 [ 13 ]アレイCGHは、患者のゲノムをリファレンスゲノムと比較し、2つのゲノム間の違いを特定し、それによって患者のゲノム不均衡領域を特定する。これは、従来のCGHと同じ競合蛍光in situハイブリダイゼーションの原理を利用している。
アレイCGHの導入により、従来のCGHの主な限界であった低解像度が克服されました。アレイCGHでは、中期染色体がクローン化されたDNA断片（+100～200kb）に置き換えられ、その正確な染色体位置が既知です。これにより、異常をより詳細に検出できるだけでなく、変化をゲノム配列に直接マッピングすることも可能になります。[ 14 ]
アレイCGHは、DNAコピー数変化の解析に用いられる他の方法と比較して、特異性、感度、迅速性、ハイスループット性に優れた技術であることが証明されており、診断用途への適用性が高い。この方法を用いることで、 5～10キロベースのDNA配列レベルでのコピー数変化を検出できる。[ 15 ] 2006年現在高解像度CGH（HR-CGH ）アレイでも、200 bpの解像度で構造変異（SV）を正確に検出できます。 [ 16 ]この方法により、染色体異常による癌や先天性欠損症などのヒト疾患における微小欠失や重複などの新たな反復染色体変化を特定できます。
アレイCGHは、従来のCGHと同じ原理に基づいています。どちらの技術でも、参照（またはコントロール）サンプルのDNAとテスト（または患者）サンプルのDNAは、2種類の異なる蛍光色素で標識され、核酸ターゲット に競合的に共ハイブリダイズするプローブとして使用されます。従来のCGHでは、ターゲットは参照中期染色体スプレッドです。アレイCGHでは、これらのターゲットは、さまざまなベクター（BACやプラスミドなど）、cDNA、またはオリゴヌクレオチドにクローニングされたゲノム断片にすることができます。[ 17 ]
図2. [ 14 ]はアレイCGH法の概略図です。検査対象のサンプルからのDNAは赤色蛍光色素（シアニン5）で標識され、参照DNAサンプルは緑色蛍光色素（シアニン3）で標識されます。2つのDNAサンプルを等量混合し、アレイ上に3回スポットされた数千個の等間隔のクローン化DNA断片またはオリゴヌクレオチドからなるDNAマイクロアレイに共ハイブリダイゼーションします。ハイブリダイゼーション後、デジタルイメージングシステムを使用して、ハイブリダイズした各蛍光色素の相対蛍光強度をキャプチャして定量化します。[ 17 ]結果として得られる蛍光強度の比率は、検査ゲノムと参照ゲノムのDNA配列のコピー数の比率に比例します。1つのプローブで蛍光色素の強度が等しい場合、患者のゲノムのこの領域は、検査サンプルと参照サンプルでDNA量が等しいと解釈されます。 Cy3:Cy5比が変化している場合は、その特定のゲノム領域における患者DNAの損失または増加を示しています。[ 18 ]
アレイ CGH は、さまざまな技術を使用して実装されています。したがって、アレイ CGH の利点と制限の一部は、選択された技術に依存します。初期のアプローチでは、BACなどの大きな挿入ゲノム DNA クローンから作成されたアレイが使用されました。BAC を使用すると、単一コピーの変化を検出し、異常境界を正確に特定するのに十分な強度のシグナルが得られます。ただし、単離された BAC クローンの初期 DNA 収量は少なく、DNA 増幅技術が必要です。これらの技術には、ライゲーション媒介ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)、1 組または複数のプライマーセットを使用した縮重プライマー PCR、およびローリング サークル増幅が含まれます。[ 19 ]アレイは cDNA を使用して構築することもできます。これらのアレイは現在、高い空間分解能を提供しますが、cDNA の数は染色体にコードされている遺伝子によって制限され、交差ハイブリダイゼーションのために感度が低くなります。[ 14 ]この結果、ゲノム全体規模で単一コピーの変化を検出することはできません。[ 20 ]最新のアプローチは、短いオリゴヌクレオチドでアレイをスポットすることです。オリゴの量はほぼ無限であり、処理は迅速で、費用対効果が高く、簡単です。オリゴヌクレオチドは単一コピーの変化を検出する感度はありませんが、染色体上で隣り合うオリゴの比率を平均化することで、感度の低下を補うことができます。[ 21 ]重複するプローブを持つアレイを使用することで、特定のブレークポイントを明らかにすることも可能になります。
CGHアプリケーション用のマイクロアレイの設計には、全ゲノムアプローチと標的アプローチの2つの方法がある。
全ゲノムアレイは、ヒトゲノム全体を網羅するように設計されています。多くの場合、ゲノム全体を広範囲にカバーするクローンと、ゲノムの範囲内で連続的にカバーするアレイが含まれています。全ゲノムアレイは主に研究用途向けに構築されており、遺伝子発見においてその優れた価値が証明されています。また、これまでにない解像度でゲノムのDNAの増減をスクリーニングするのにも非常に役立ちます。[ 17 ]
ターゲットアレイは、ゲノムの特定の領域を対象として設計されており、その対象セグメントを評価することを目的としています。特定の染色体または染色体セグメントを研究したり、微小欠失症候群またはサブテロメア再編成が疑われる個人の特定のDNA量異常を特定および評価したりするために設計される場合があります。医療現場におけるターゲットマイクロアレイの重要な目標は、不均衡な細胞遺伝学的異常の診断、遺伝カウンセリング、予後、および臨床管理に臨床的に有用な結果を提供することです。[ 17 ]
従来のCGHは、主に腫瘍で繰り返し欠失または獲得される染色体領域の同定、および癌の診断と予後に使用されてきました。[ 22 ]このアプローチは、胎児および新生児のゲノムにおける染色体異常の研究にも使用できます。さらに、従来のCGHは染色体異常の検出に使用でき、ヒト遺伝性疾患に関連する複雑な異常の診断に効果的であることが示されています。[ 14 ]
同じ腫瘍タイプの複数の研究からの CGH データは、非ランダムな遺伝子異常の一貫したパターンを示しています。[ 23 ]これらの変化の一部は、さまざまな種類の悪性腫瘍に共通しているようですが、他の変化はより腫瘍特異的です。たとえば、染色体領域 1q、3q、および 8q の増加、ならびに 8p、13q、16q、および 17p の減少は、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、腎臓がん、膀胱がんなど、多くの腫瘍タイプに共通しています (図 3)。精巣がんにおける 12p および Xp の増加、膀胱がんにおける 13q の増加および 9q の減少、腎臓がんにおける 14q の減少、卵巣がんにおける Xp の減少などの他の変化はより特異的であり、さまざまな臓器でのがん発生中に作用する独自の選択力を反映している可能性があります。[ 23 ]アレイCGHは、慢性リンパ性白血病などのB細胞悪性腫瘍の研究や診断にも頻繁に使用されています。
猫鳴き症候群（CdC）は、5番染色体の短腕の部分欠失によって引き起こされる症候群です。[ 24 ]いくつかの研究では、従来のCGH法が欠失だけでなく、より複雑な染色体異常の検出にも適していることが示されています。例えば、Levyら（2002）は、CdCの特徴である猫のような鳴き声を発するものの、核型が不明瞭な乳児を報告しました。CGH分析により、5p15.3からの染色体物質の欠失が明らかになり、臨床診断が確定しました。これらの結果は、従来のCGH法が構造異常の検出において信頼できる技術であり、特定の場合には複雑な異常の診断においてより効率的である可能性があることを示しています。[ 24 ]
アレイCGHアプリケーションは主に癌におけるゲノム異常の検出を目的としています。しかし、アレイCGHはヒト遺伝性疾患を引き起こすDNAコピー数異常の解析にも適しています。[ 14 ]つまり、アレイCGHは欠失、増幅、切断点、倍数性異常を明らかにするために用いられます。早期診断は患者にとって有益であり、適切な治療やカウンセリングを受けて予後を改善することができます。[ 10 ]
がんでは遺伝子変異や再編成が頻繁に起こり、その病因に寄与する。アレイCGHによるこれらの異常の検出は、重要な癌遺伝子の位置に関する情報を提供し、診断、癌の分類、予後予測において臨床的に有用である可能性がある。[ 17 ]しかし、免疫グロブリンサブ遺伝子の再編成中に生理的にDNA物質が失われるため、遺伝物質の喪失のすべてが病原性を持つわけではない。最近の研究では、アレイCGHが乳癌のいくつかのマウスモデルにおける染色体異常（コピー数変異）領域を特定するために実施され、myc誘導性発癌中の協力遺伝子の特定につながった。[ 25 ]
アレイCGHは、がんにおける染色体異常の発見だけでなく、腫瘍の進行のモニタリングにも応用できる。アレイCGHによって異常が特定された後は、FISHを用いて転移性病変と原発性病変または悪性度の不確かな腫瘍を区別することも可能。[ 5 ] [ 10 ]
プラダー・ウィリー症候群（PWS）は、15q11-13 に関わる父親の構造異常であり、同じ領域の母親の異常がアンジェルマン症候群（AS）を引き起こします。どちらの症候群でも、症例の大部分（75%）は、PWS/AS クリティカル領域の 3～5 Mb の欠失の結果です。[ 26 ]これらの小さな異常は、細胞遺伝学や従来の CGHでは検出できませんが、アレイ CGH を使用すると容易に検出できます。原理実証として、Vissers ら（2003）は、既知の FISH で確認された微小欠失症候群の患者 3 人（PWS の患者 1 人を含む）をスクリーニングするために、1 Mb の解像度を持つゲノムワイドアレイを構築しました。3 例すべてで、1.5～2.9 Mb の範囲の異常が容易に特定されました。[ 27 ]このように、アレイ CGH は、微細な異常を検出するのに特異で感度の高いアプローチであることが実証されました。
重複マイクロアレイを使用すると、染色体異常に関わる切断点も明らかにすることができる。
アレイ CGH は着床前遺伝子スクリーニングのツールとしてはまだ広く用いられている技術ではありませんが、ますます人気が高まっている概念です。この技術は、卵子、精子、または胚における CNV や異数性を検出する可能性があり、これらは胚の着床不全、流産、またはダウン症候群 (21 トリソミー) などの状態の原因となる可能性があります。このため、アレイ CGH は、生活を変えるような状態の発生率を減らし、体外受精の成功率を向上させる有望なツールとなっています。この技術では、単一の細胞から全ゲノムを増幅し、それをアレイ CGH 法で使用します。また、バランス型相互転座やロバートソン型転座などの染色体転座を持つカップルにも使用できます。これらの転座は、子孫に染色体異常を引き起こす可能性があります。[ 12 ] [ 28 ] [ 29 ]
従来の CGH の主な欠点は、モザイク現象、バランス型染色体転座、逆位など、コピー数変化を伴わない構造的染色体異常を検出できないことです。CGH は倍数性レベルに対するゲインとロスしか検出できません。[ 30 ]さらに、短い反復 DNA 配列を持つ染色体領域は個人間で非常に変動が大きく、CGH 分析を妨げる可能性があります。[ 14 ]したがって、セントロメアやテロメアなどの反復 DNA 領域は、非標識反復 DNA (例: Cot1 DNA) でブロックするか、スクリーニングから除外する必要があります。[ 31 ]さらに、従来の CGH の解像度は、臨床応用を制限する主要な実用上の問題です。CGH は、癌とヒト遺伝性疾患の両方の研究と診断において有用で信頼性の高い技術であることが証明されていますが、その応用は大きな異常のみを対象としています。中期染色体の解像度が限られているため、従来の CGH では 5〜10 Mb 未満の異常は検出できません。[ 23 ] このような異常を検出するには、高解像度技術が必要です。アレイ CGH は、これらの制限の多くを克服します。アレイ CGH は高解像度を特徴としており、これは従来の CGH に対する主な利点です。標準解像度は 1〜5 Mb ですが、アレイにクローンを追加することで約 40 kb まで上げることができます。ただし、従来の CGH と同様に、アレイ CGH の主な欠点は、コピー数の変化をもたらさない異常を検出できないことと、モザイク現象の検出能力が限られていることです。[ 14 ]検出できるモザイク現象のレベルは、クローンの感度と空間解像度に依存します。現在、細胞の約 50% に存在する再編成が検出限界です。このような異常を検出するには、SKY（スペクトル核型分析）やFISHなどの他の技術を依然として使用する必要がある。[ 32 ]