形質転換

このアプローチでは、標的細胞型の前駆細胞由来の転写因子を体細胞に導入して分化転換を誘導します。 ^{[ 2 ]}使用する転写因子を決定する方法は2つあります。1つは、多数の転写因子から始めて1つずつ絞り込んでいく方法^{[ 19 ]}、もう1つは、1つか2つから始めてさらに追加していく方法です。^{[ 20 ]}正確な詳細を説明する理論の1つは、異所性転写因子が細胞をより初期の前駆細胞状態に誘導し、その後新しい細胞型に方向転換させるというものです。DNAメチル化またはヒストン修飾によるクロマチン構造の再編成も役割を果たしている可能性があります。^{[ 21 ]}以下は、in vitroの例とin vivoの例のリストです。特定のマウス細胞にトランスフェクションを行うin vivo法では、ベクターを特定の臓器に注入する点を除いて、 in vitro実験と同じ種類のベクターを使用します。Zhou et al. (2008)は、高血糖を改善するために、マウスの背側脾臓葉（膵臓）にNgn3、Pdx1、Mafaを注入して膵臓外分泌細胞をβ細胞に再プログラムした。 ^{[ 22 ]}

体細胞は、まず多能性再プログラミング因子（Oct4、Sox2、Nanogなど）で一時的にトランスフェクトされ、その後、目的の阻害因子または活性化因子でトランスフェクトされます。^{[ 23 ]}以下は、試験管内での例のリストです。

DNAメチル化阻害剤である5-アザシチジンは、心筋細胞から骨格筋芽細胞への表現型転換を促進することも知られている。^{[ 24 ]}

前立腺癌では、アンドロゲン受容体標的療法による治療により、一部の患者で神経内分泌分化転換が誘発される。^{[ 25 ] [ 26 ]}これらの患者に対する標準治療は存在せず、治療誘発性神経内分泌癌と診断された患者は通常、緩和治療を受ける。^{[ 27 ]}

転写因子は、不可逆的なプロセスの短期的な引き金として機能します。pdx1を1回注射してから8か月後に観察された肝細胞の分化転換。^{[ 13 ]}

異所性転写因子は、各細胞における宿主遺伝子発現レパートリーをオフにする。しかし、代替の望ましいレパートリーは、素因のある細胞のサブポピュレーションでのみオンになる。^{[ 28 ]}大規模な脱分化にもかかわらず、系統追跡アプローチは、トランス分化が成体細胞に由来することを実際に示している。^{[ 29 ]}

各細胞変換に必要な操作すべき細胞因子の固有のセットを決定することは、試行錯誤を繰り返す長い時間とコストのかかるプロセスです。そのため、細胞変換のための重要な細胞因子のセットを特定するこの最初のステップは、細胞リプログラミングの分野で研究者が直面する大きな障害となっています。国際的な研究チームは、あるヒト細胞型を別のヒト細胞型に変換するために必要な最適な細胞因子のセットを予測できるアルゴリズム、Mogrify(1)を開発しました。テストの結果、Mogrifyは、以前に発表された細胞変換に必要な細胞因子のセットを正確に予測することができました。Mogrifyの予測能力をさらに検証するために、チームはヒト細胞を使用して実験室で2つの新しい細胞変換を実施し、Mogrifyの予測のみを使用して両方の試みで成功しました。^{[ 30 ] [ 31 ] [ 32 ]} Mogrifyは、他の研究者や科学者向けにオンラインで公開されています。

形質転換細胞を調べる際には、標的細胞型のマーカーとドナー細胞マーカーの欠如を確認することが重要であり、これは緑色蛍光タンパク質または免疫検出法を用いて行うことができる。また、細胞機能、エピゲノム、トランスクリプトーム、プロテオームのプロファイルを調べることも重要である。細胞は、生体内で対応する組織に統合され、機能的にその天然の対応物を置き換える能力に基づいて評価することもできる^{[ 19 ]}。ある研究では、転写因子Gata4、Hnf1α、Foxa3 、およびp19(Arf)の不活性化を用いて尾部先端線維芽細胞を肝細胞様細胞に形質転換させたところ、生存率を評価手段として用いた場合、半数のマウスでのみ肝細胞様肝機能が回復した^{[ 33 ] 。}

一般的に、マウス細胞で起こる分化転換は、ヒト細胞では有効性や迅速性には結びつかない。Pangらは、転写因子Ascl1、Brn2、Myt1lがマウス細胞を成熟ニューロンに変化させる一方で、同じ因子群はヒト細胞を未成熟ニューロンにしか変化させないことを発見した。しかし、 NeuroD1を加えることで効率が向上し、細胞が成熟するのを助けることができた。^{[ 34 ]}

転写因子の発現順序は細胞の運命を左右する可能性がある。岩崎ら（2006）は、造血系において、Gata-2と（C/EBPα）の発現タイミングによって、リンパ系に分化した前駆細胞が顆粒球/単球前駆細胞、好酸球、好塩基球、または二能性好塩基球/肥満細胞前駆細胞系統に分化できるかどうかが変わることを示した。^{[ 35 ]}

誘導多能性幹細胞をマウスに注入すると、相乗効果のあるマウスの免疫系が形成された奇形腫を拒絶することがわかっています。これは、免疫系が注入された細胞の特定の配列のエピジェネティックマーカーを認識したためである可能性があります。しかし、胚性幹細胞を注入した場合、免疫応答ははるかに低かった。これが分化転換細胞内で起こるかどうかは、まだ研究が必要です。^{[ 3 ]}

トランスフェクションを達成するには、レンチウイルスやレトロウイルスなどの組み込み型ウイルスベクター、センダイウイルスやアデノウイルスなどの非組み込み型ベクター、マイクロRNA、およびタンパク質やプラスミドの使用を含むさまざまな他の方法を使用できます。^{[ 36 ]} 1つの例として、ポリマーキャリアを使用して転写因子をコードするプラスミドを非ウイルス的に送達し、線維芽細胞の神経分化転換を誘導する方法があります。^{[ 37 ]}外来分子が細胞に入ると、起こりうる欠点や腫瘍性増殖を引き起こす可能性を考慮する必要があります。組み込み型ウイルスベクターは、ゲノムに挿入されると突然変異を引き起こす可能性があります。これを回避する方法の1つは、再プログラミングが起こった後にウイルスベクターを切除することであり、Cre-Lox組換えの例があります。 ^{[ 38 ]}非組み込み型ベクターは、再プログラミングの効率とベクターの除去に関して他の問題があります。^{[ 39 ]}