神経誘導導管

神経誘導導管（人工神経導管または人工神経移植片とも呼ばれ、自家移植とは対照的）は、軸索の再生を誘導して神経再生を促進する人工的な手段であり、神経損傷の臨床治療の1つです。切断された神経の2つの断端を張力なしで直接縫合できない場合、末梢神経損傷の標準的な臨床治療は自家神経移植です。ドナー組織の入手が限られており、自家神経移植では機能回復が限られているため、神経組織工学研究では、特に大きな欠損に対する代替治療として、バイオ人工神経誘導導管の開発に焦点が当てられています。同様の技術が脊髄の神経修復にも研究されていますが、中枢神経系の神経再生は、軸索が本来の環境では目立った再生を示さないため、より大きな課題となります。^[1]

人工導管の作成は、神経末端と介在ギャップが生物学的または合成材料で構成されたチューブ内に囲まれているため、管内挿術とも呼ばれます。 ^[2]導管が生物学的チューブ、合成チューブ、または組織工学導管のいずれの形態であっても、神経ギャップの近位端と遠位端の間の神経向性および神経栄養性のコミュニケーションを促進し、外部の阻害因子をブロックし、軸索の再生のための物理的なガイダンスを提供する必要があります。^[3]神経誘導導管の最も基本的な目的は、組織形成を促進する条件下で物理的、化学的、および生物学的な手がかりを組み合わせることです。^[4]

生物学的チューブの製造に使用されてきた材料には血管や骨格筋などがあり、非吸収性および生体吸収性の合成チューブはそれぞれシリコンとポリグリコリドから作られています。^[5]組織工学による神経誘導導管は、足場構造、足場材料、細胞療法、神経栄養因子、生体模倣材料など、多くの要素の組み合わせです。使用する物理的、化学的、生物学的な手がかりの選択は、神経環境の特性に基づいており、これは軸索再生に最も望ましい環境を作り出す上で重要です。材料の選択を制御する要因には、生体適合性、生分解性、^[6]機械的完全性、^[3]神経成長、移植、滅菌中の制御可能性などがあります。

組織工学では、足場構造の 3 つの主なレベルは次のとおりであると考えられています。

• 上部構造、足場の全体的な形状。
• 表面の微細構造、細胞レベルの構造、そして
• ナノ構造、つまり細胞レベルの表面構造。^[7]

導管または足場の上部構造は、神経組織形成の生体内条件をシミュレートするために重要です。組織の成長と形成を導く主な役割を担う細胞外マトリックスは、多数の絡み合った繊維状分子によって作られた複雑な上部構造を持っています。人工の上部構造を形成する方法には、熱応答性ハイドロゲル、縦方向のチャネル、縦方向の繊維、伸張成長軸索、ナノファイバー足場の使用などがあります。

外傷性脳損傷（TBI）では、一連の損傷イベントが開始され、細胞死と全体的な機能障害につながり、不規則な形状の病変空洞の形成を引き起こします。^[8]結果として生じる空洞は、侵襲的な移植が必要であり、多くの場合、スキャフォールドが空洞の形状に適合しないため、組織工学スキャフォールドにとって多くの問題を引き起こします。これらの困難を回避するために、熱応答性ハイドロゲルは、室温と生理学的温度の違いによって引き起こされる溶液-ゲル化（ゾル-ゲル）遷移を起こすように設計されており、その場でのゲル化と空洞形状への適合を通じて移植を容易にし、最小限の侵襲で注入できるようにしています。^[8]

メチルセルロース（MC）は、最適な温度範囲でゾル-ゲル転移が明確に定義された材料です。MCのゲル化は、温度が上昇するにつれて分子内および分子間の疎水性相互作用が増加するため発生します。^[8]ゾル-ゲル転移は、弾性率が粘性率に等しくなる温度である下限臨界溶解温度（LCST）によって制御されます。スキャフォールドが移植時にゲル化し、低侵襲性の送達を実現するには、LCSTが生理学的温度（37℃）を超えてはなりません。TBI病変腔または末梢神経誘導導管への移植後、MCは最小限の炎症反応を引き起こします。^[8]また、低侵襲性の送達には、MC溶液がLCST未満の温度で粘度を持つことが非常に重要です。これにより、生体内アプリケーションでの移植のために小ゲージ針で注入できます。^[8] MCは眼内および経口薬療法の送達剤として効果的に使用されています。^[8] MCの欠点としては、タンパク質吸着や神経細胞接着の傾向が限られているため、非生物活性ハイドロゲルになることが挙げられます。これらの欠点のため、神経組織の再生にMCを使用する場合は、細胞接着を強化するためにポリマー骨格に生物学的に活性な基を結合させる必要があります。

もう一つの熱応答性ゲルは、キトサンとグリセロリン酸 (GP) 塩を組み合わせて作られるゲルです。 ^[9]この溶液は、37 °C を超える温度でゲル化します。キトサン/GP のゲル化はかなり遅く、最初に固まるまでに 30 分、完全に安定するまでにさらに 9 時間かかります。ゲルの強度は、キトサンの濃度に応じて 67 ～ 1572 Pa の範囲で変化します。この範囲の下限は、脳組織の硬さに近づきます。キトサン/GP は試験管内での成功が示されていますが、神経細胞の接着を強化するにはポリリジンの添加が必要です。ポリリジンは、キトサンが拡散するのを防ぐためにキトサンに共有結合しました。ポリリジンが選択された理由は、その陽性特性と高い親水性により神経突起の成長が促進されるからです。ニューロンの生存率は 2 倍になりましたが、神経突起の成長はポリリジンの添加によって変化しませんでした。^[9]

縦方向のチャネルは、再生中の軸索が足場に沿ってまっすぐに成長するための明確なガイドを与えるために導管に追加できるマクロ構造です。微小管チャネル構造を持つ足場では、再生中の軸索は、末梢神経の神経内膜管を通って通常伸びるのと同じように、開いた縦方向のチャネルを通って伸びることができます。^[10]さらに、チャネルは細胞接触に利用できる表面積を増やします。チャネルは通常、針、ワイヤ、または2番目のポリマー溶液をポリマー足場内に挿入することによって作成されます。メインポリマーの形状を安定させた後、針、ワイヤ、または2番目のポリマーを除去してチャネルを形成します。通常は複数のチャネルが作成されますが、足場は1つの大きなチャネル、つまり1つの中空チューブだけで構成することもできます。

王らは、多チャネルの内部マトリックスとキトサン製の外管壁を備えた神経誘導導管を形成するための成形技術を開発した。^[10] 2006 年の研究では、王らは中空のキトサン管に鍼を通し、両端に CAD を使用して作成したパッチを固定して鍼を所定の位置に保持した。次に、キトサン溶液を管に注入して固め、その後鍼を取り除き、縦方向のチャネルを作成する。次に、直径 400 μm の鍼を使用して 21 のチャネルを持つ代表的なスキャフォールドを作成し、特性を評価した。顕微鏡で調べたところ、チャネルはわずかに不規則ではあるもののほぼ円形であることが判明し、すべてのチャネルは外管壁の内径と一致していた。マイクロ CT 画像により、チャネルがスキャフォールドの全長にわたっていることが確認された。吸水すると、足場の内径と外径は大きくなりましたが、チャネル径は大きく変化しませんでした。これは、神経突起の伸長を導く足場の形状を維持するために必要です。内部構造により、中空チューブのみに比べて圧縮強度が向上し、成長中の神経突起上での足場の崩壊を防ぐことができます。Neuro-2a細胞は足場の内部マトリックス上で成長することができ、チャネルに沿って配向しました。この方法はキトサンでのみテストされていますが、他の材料に合わせて調整できます。^[10]

凍結乾燥およびワイヤ加熱プロセスは、縦方向のチャネルを作成する別の方法で、Huang ら (2005) によって開発されました。^[11]キトサンと酢酸の溶液を液体窒素トラップ内のニッケル銅 (Ni-Cu) ワイヤの周囲で凍結し、その後ワイヤを加熱して除去しました。Ni-Cu ワイヤが選択された理由は、抵抗レベルが高いためです。酢酸を昇華させるために、温度制御された凍結乾燥装置を使用しました。チャネルが融合または分割された形跡はありませんでした。凍結乾燥後、スキャフォールドの寸法が縮小し、チャネルが使用したワイヤよりも少し小さくなりました。スキャフォールドは、塩基を使用して生理学的 pH 値に中和されましたが、これは多孔質構造に劇的な影響を及ぼしました。^[11]より弱い塩基は多孔質構造を均一に保ちましたが、より強い塩基はそれを制御不能にしました。ここで使用した技術は、他のポリマーや溶媒に対応するためにわずかに変更できます。^[11]

縦配向チャネルを作成する別の方法は、別のポリマーの縦配向繊維を埋め込んだ１つのポリマーから導管を作成し、次に繊維を選択的に溶解して縦配向チャネルを形成することである。ポリカプロラクトン（PCL）繊維を（ヒドロキシエチル）メタクリレート（HEMA）スキャフォールドに埋め込んだ。PCLはHEMAには不溶だがアセトンには溶解するため、ポリ乳酸（PLA）やポリ乳酸グリコール酸（PLGA）よりも選択された。HEMAは主な導管材料として使用され、アセトンはポリマー繊維を選択的に溶解するために使用されたため、これは重要である。押し出されたPCL繊維をガラス管に挿入し、HEMA溶液を注入した。作成されたチャネルの数はバッチ間で一定であり、繊維径のばらつきは、より制御されたPCL繊維押し出しシステムを作成することで低減できる。[ ^12]このプロセスは安全で再現性があり、寸法も制御可能です。^[12] YuとShoichet (2005)が実施した同様の研究では、HEMAをAEMAと共重合させてP(HEMA-co-AMEA)ゲルを作成しました。ポリカプロラクトン(PCL)繊維をゲルに埋め込み、アセトンで選択的に溶解して超音波処理し、チャネルを作成しました。1% AEMAと混合したHEMAが最も強力なゲルを作成することがわかりました。^[13]チャネルのないスキャフォールドと比較すると、82〜132のチャネルを追加すると表面積が約6〜9倍に増加し、接触を介したキューに依存する再生研究に有利になる可能性があります。^[13]

伊藤ら（2003）は、カニのキトサン腱を使用して作成された、単一の大きな縦方向チャネルからなるスキャフォールドを開発した。^[14]腱はカニ（Macrocheira kaempferi）から採取され、タンパク質を除去して腱キチンを脱アセチル化するために水酸化ナトリウム溶液で繰り返し洗浄され、後に腱キトサンとして知られるようになった。三角形の断面（各辺の長さ2.1 mm）を持つステンレス鋼の棒を、円形断面（直径：2 mm、長さ：15 mm）の中空の腱キトサンチューブに挿入した。円形チューブと三角形チューブを比較すると、三角形チューブは機械的強度が向上し、形状をよりよく保持し、利用可能な表面積が増加することが判明した。^[14]これは単一のチャネルを作成するための効果的な方法ですが、マルチチャネルスキャフォールドほど細胞の成長のための表面積は多くありません。

Newman ら (2006) は、導電性繊維と非導電性繊維をコラーゲン-TERP スキャフォールド (ポリ (N-イソプロピルアクリルアミド) (PNiPAAm) の三元共重合体で架橋したコラーゲン) に挿入しました。繊維は小さなガラススライドにしっかりと巻き付け、それと別のガラススライドの間にコラーゲン-TERP 溶液を挟むことで埋め込まれました。ガラススライド間のスペーサーにより、ゲルの厚さは 800 μm に設定されました。導電性繊維は炭素繊維とケブラーであり、非導電性繊維はナイロン 6 とタングステン線でした。神経突起は炭素繊維上で太い束になって全方向に伸びますが、他の 3 つの繊維では、神経突起は細かいクモの巣状の構造で伸びます。神経突起は炭素繊維とケブラー繊維上では方向性を示さなかったが、ナイロン 6 繊維に沿って、またある程度はタングステン線に沿って成長しました。タングステン線とナイロン6繊維の足場は、表面に沿って成長するだけでなく、繊維とゲルの界面付近のゲル内に神経突起が成長していた。ケブラー以外のすべての繊維ゲルは、非繊維ゲルと比較して神経突起の伸長が大幅に増加した。非導電性繊維と導電性繊維の神経突起の伸長には差がなかった。^[15]

2005年の研究では、Caiらは中空のポリ乳酸（PLA）とシリコンチューブにポリ（L-乳酸）（PLLA）マイクロフィラメントを加えました。マイクロファイバーの誘導特性は繊維の直径と反比例しており、直径が小さいほど縦方向の細胞移動と軸索再生が促進されました。マイクロファイバーは末梢神経修復中の髄鞘形成も促進しました。^[16]

成熟した軸索束は、軸索シリンダーの中央部分を機械的に伸ばすと成長することが実証されています。^[17]このような機械的伸ばしは、カスタム設計された軸索伸張成長バイオリアクターによって適用されました。このバイオリアクターは、カスタム設計された軸索拡張チャンバー、リニアモーションテーブル、ステッピングモーター、コントローラーの4つの主要コンポーネントで構成されています。^[17]神経組織培養は、ガス交換用のポートと取り外し可能な伸張フレームを備えた拡張チャンバー内に配置され、2つのグループの細胞体（ニューロン細胞体）を分離して軸索を伸ばすことができます。^[17]コラーゲンゲルは、肉眼で見える、より大きな伸張成長軸索束の成長を促進するために使用されました。コラーゲンコーティングによる成長促進には2つの理由があります。1)コラーゲンが乾燥すると培養物が疎水性になり、より高密度のニューロンが成長できるようになり、2)コラーゲンコーティングによって2つの伸長基質全体に遮るもののないコーティングが作成されたためです。^[17]走査型電子顕微鏡と透過型電子顕微鏡による検査では、伸張による軸索の細化の兆候は見られず、細胞骨格は正常で無傷のように見えました。伸張成長した軸索束は生体適合性膜上で培養され、移植用の円筒形構造に直接形成することができ、成長が完了した後に軸索を足場に移す必要がなくなりました。伸張成長した軸索は、わずか8日間の順応で1 cm/日という前例のない速度で成長することができ、これは成長円錐の伸張で測定された最大成長速度1 mm/日よりもはるかに速いものです。1 mm/日の速度は、神経フィラメントなどの構造要素の平均輸送速度でもあります。^[17]

ナノスケール繊維の研究では、方向性のある成長と再生を促進するために、生体内の細胞外環境を模倣しようとしています。 ^[7]ナノファイバー足場を形成する3つの異なる方法は、自己組織化、相分離、および電界紡糸です。ただし、ナノファイバー足場を形成する方法は他にもたくさんあります。

ナノファイバー足場の自己組織化は、繊維自体が自己組織化するように設計されている場合にのみ発生します。足場繊維の自己組織化を促進する一般的な方法の 1 つは、両親媒性ペプチドを使用して、水中で疎水性部分が自己組織化を促進することです。^[7]両親媒性ペプチドを慎重に計算して設計することで、自己組織化マトリックスを正確に制御できます。自己組織化により、整列したトポグラフィーと整列していないトポグラフィーの両方を作成できます。Phillips ら (2005) は、自己整合コラーゲン-シュワン細胞マトリックスをin vitroおよびin vivoで開発およびテストし、これによりin vitro でDRG ニューライト延長の整列が可能になりました。コラーゲン ゲルは、3 次元組織培養の基質として広く使用されています。細胞はコラーゲンとインテグリンを介した付着を形成することができ、これが細胞骨格の組み立てと細胞の運動性を開始します。細胞がコラーゲン繊維に沿って移動すると、ゲルを収縮させる力が発生します。コラーゲン繊維が両端で繋がれていると、細胞が生成した力によって一軸歪みが生じ、細胞とコラーゲン繊維が整列します。このマトリックスの利点は、調製が簡単で速いことです。^[2]可溶性血漿フィブロネクチンは、粘性溶液内で直接機械的せん断を受けると、安定した不溶性繊維に自己組織化することもできます。 Phillips ら (2004) は、凝集の改善をもたらす新しいせん断凝集法を調査しました。^[18]機械的せん断は、0.2 ml の塊をピンセットで 3 cm まで引き出すことによって作成され、限外濾過セル内の急速に移動する界面でフィブロネクチンが不溶性繊維に凝集します。この繊維凝集の提案されているメカニズムは、機械的せん断力下でのタンパク質の伸長と伸張であり、これが繊維の横方向のパッキングとタンパク質凝集につながります。 Phillips ら高粘度フィブロネクチンゲルを伸張させることで生じる機械的せん断がゲルの構造に大きな変化を引き起こし、一軸伸張によって適用すると粘性フィブロネクチンゲルが配向した繊維状フィブロネクチン凝集体を形成することが示されました。さらに、繊維状凝集体は溶解性が低下し、in vitroでさまざまな細胞タイプをサポートできます。^[18]

相分離により、特殊な装置を使用せずに、3次元のサブマイクロメートル繊維スキャフォールドを作成できます。相分離には、ポリマーの溶解、相分離とゲル化、ゲルからの溶媒抽出、凍結、水中での凍結乾燥の5つのステップが含まれます。^[7]最終製品は連続繊維ネットワークです。相分離は、さまざまな用途に合わせて変更でき、さまざまな溶媒を使用することで細孔構造を変えることができます。これにより、プロセス全体を液体-液体から固体-液体に変更できます。多孔性と繊維径は、ポリマーの初期濃度を変えることでも変更できます。初期濃度が高いほど、細孔が少なくなり、繊維径が大きくなります。この技術を使用して、直径がI型コラーゲン繊維の直径に達する繊維ネットワークを作成できます。作成された繊維ネットワークはランダムに配向されており、これまでのところ、繊維を整理する作業は行われていません。相分離は、高多孔性のナノファイバースキャフォールドを簡単に作成するために広く使用されている技術です。^[7]

電界紡糸は、合成神経誘導導管の開発に堅牢なプラットフォームを提供します。電界紡糸は、さまざまな化学的性質と地形を持つ制御された寸法の足場を作成するのに役立ちます。さらに、粒子、成長因子、さらには細胞を含むさまざまな材料を繊維内にカプセル化できます。^[19] 電界紡糸では、ポリマー溶融物または溶液の液滴を電気的に帯電させ、それを毛細管から吊り下げることで繊維を作成します。次に、毛細管の一端に電界を適用して、電荷が表面張力を超えると、伸びて薄くなるポリマージェットが生成されます。このポリマージェットはテイラーコーンとして放電し、帯電したポリマーを残します。溶媒がジェットから蒸発すると、接地された表面に溶媒として集められます。^[20] 直径が3 nm未満から1 μmを超える繊維が紡がれています。このプロセスは、ポリマーの種類、ポリマーの分子量、溶液の特性などのシステムパラメータ、および流量、電圧、毛細管の直径、コレクターと毛細管の間の距離、コレクターの動きなどのプロセスパラメータによって影響を受けます。^[21]作成された繊維ネットワークは無秩序であり、高多孔度の結果として高い表面積対体積比を備えています。大きなネットワーク表面積は、神経組織工学における老廃物や栄養素の成長と輸送に最適です。^[7]神経組織工学に有利な電界紡糸スキャフォールドの2つの特徴は、ECMを厳密に模倣する形態と構造、および栄養素の交換を可能にしながらグリア瘢痕組織の成長を防ぐ適切なサイズの範囲である孔です（約10μm）。^[22]ランダム電界紡糸PLLAスキャフォールドは、表面粗さの増加が原因である可能性がある細胞接着が増加することが実証されています。^[22] 化学的に修飾された電界紡糸繊維マットは、神経幹細胞の分化に影響を与え、細胞増殖を増加させることも示されています。^[20]過去10年間で、科学者は、細胞に追加の地形的手がかりを提供するのに役立つ整列ナノファイバー足場を製造するためのさまざまな方法も開発しました。^[23]これは、従来の製造技術では大規模な3次元整列足場を簡単に作成できないため有利です。^[7]Yang ら (2005) が実施した研究では、整列およびランダムに電界紡糸されたポリ (L-乳酸) (PLLA) マイクロファイバーおよびナノファイバー スキャフォールドが作成され、特性評価および比較されました。繊維の直径は、電界紡糸に使用された初期のポリマー濃度に正比例し、同一の処理条件下では、整列繊維の平均直径はランダム繊維の直径よりも小さかったです。神経幹細胞は、整列電界紡糸繊維と平行に伸長することが示されました。^[21]整列ナノファイバーは、整列マイクロファイバー、ランダムマイクロファイバー、およびランダムナノファイバーと比較して、平均神経突起長が長かったです。さらに、整列ナノファイバーでは、整列マイクロファイバーよりも多くの細胞が分化しました。^[21]したがって、この研究の結果は、神経再生を促進するために、整列ナノファイバーが非整列繊維またはマイクロファイバーよりも有益である可能性があることを実証しました。

マイクロ構造とナノ構造は、上部構造とともに、スキャフォールドのトポグラフィーを作成する際に考慮する価値のある 3 つの主要なレベルのスキャフォールド構造です。^[7]上部構造はスキャフォールドの全体的な形状を指しますが、マイクロ構造は表面の細胞レベルの構造を指し、ナノ構造は表面の細胞内レベルの構造を指します。3 つの構造レベルはすべて細胞反応を引き起こすことができますが、細胞外マトリックス内に多数のナノスケール構造が存在することから、ナノスケールのトポグラフィーに対する細胞の反応に大きな関心が寄せられています。^[7]マイクロ構造とナノ構造を製造するための方法はますます増えており (多くは半導体産業に由来)、制御されたサイズ、形状、化学特性を持つさまざまなトポグラフィーを作成できます。^[24]

物理的手がかりは、マイクロ構造および/またはナノ構造のレベルで秩序だった表面構造を作り出すことによって形成されます。ナノスケールの物理的手がかりは、細胞の接着、移動、配向、接触阻害、遺伝子発現、および細胞骨格形成を調節することが示されています。これにより、増殖、分化、拡散などの細胞プロセスの方向付けが可能になります。^[24]マイクロスケールおよびナノスケールのトポグラフィーを製造する方法は数多くありますが、秩序だったトポグラフィーを作成する方法と秩序のないトポグラフィーを作成する方法に分けられます。

整然とした地形とは、組織化され幾何学的に正確なパターンとして定義されます。^[7]整然とした地形を作成する方法は数多くありますが、通常は時間がかかり、スキルと経験、高価な機器の使用が必要です。^[7]

フォトリソグラフィーでは、フォトレジストを塗布したシリコン ウェハーに光源を当てます。光源とウェハーの間に、目的のパターンが描かれたマスクを配置することで、選択的に光を透過させ、フォトレジスト上にパターンを形成します。ウェハーをさらに現像すると、フォトレジストのパターンが浮かび上がります。近紫外線で行われるフォトリソグラフィーは、マイクロ スケールのトポグラフィーを製造するための標準と見なされることが多いです。 ^[7]ただし、サイズの下限は波長の関数であるため、この方法はナノスケールの特徴を作成するのには使用できません。 ^[7] 2005 年の研究では、Mahoney らは、フォトリソグラフィーによってガラス基板上にポリイミドチャネル (高さ 11 μm、幅 20～60 μm) の整然としたアレイを作成しました。 ^[25]ポリイミドが使用されたのは、ガラスによく付着し、水溶液中で化学的に安定しており、生体適合性があるためです。マイクロチャネルは、神経突起成長円錐内の細胞骨格要素が蓄積、集合、配向できる角度の範囲を制限しているという仮説があります。 ^[25]細胞体から出現する神経突起の数は大幅に減少しましたが、神経突起が出現する角度の範囲が広がるにつれて減少は小さくなりました。また、ニューロンをマイクロチャネル上で培養した場合、平らな表面上の対照群と比較して神経突起は平均で2倍長くなりました。これは、フィラメントのより効率的な配列によるものと考えられます。 ^[25]

電子ビームリソグラフィー（EBL）では、電子感応性レジストを高エネルギー電子ビームにさらします。ポジ型またはネガ型のレジストを選択できますが、ネガ型レジストでは、より低い特徴解像度が得られます。^[26]パターンは、材料の表面に沿って正確な経路をたどるように電子ビームをプログラムすることによって作成されます。解像度は、レジスト内の電子散乱や基板からの後方散乱などの他の要因によって影響を受けます。EBL は、3～5 nm のオーダーの単一の表面特徴を作成できます。組織工学の場合のように、大きな表面積に複数の特徴が必要な場合は、解像度が低下し、30～40 nm ほどの小さな特徴しか作成できず、レジストの開発がパターン形成に大きく影響し始めます。^[26]レジストの溶解を防ぐために、超音波撹拌を使用して分子間力を克服することができます。さらに、イソプロピルアルコール（IPA）は高密度アレイの開発に役立ちます。 EBLは、高分子材料にナノメートルパターンを複製することで、より迅速で低コストのプロセスになる可能性があります。複製プロセスは、ホットエンボス加工と溶媒キャストを使用したポリカプロラクトン（PCL）で実証されています。^[7] Gomezら（2007）が実施した研究では、PDMS上にEBLによって作成された幅1μmと2μm、深さ400nmと800nmのマイクロチャネルが、固定化された化学信号よりも培養中の海馬細胞の軸索形成を促進することが示されました。^[26]

X 線リソグラフィーは、神経突起形成を促進する上で地形が果たす役割を調べるために使用できる、秩序だったパターンを形成する別の方法です。マスク パラメータによってパターンの周期が決まりますが、隆起の幅と深さはエッチング条件によって決まります。ある研究では、400 ～ 4000 nm の周期、70 ～ 1900 nm の幅、600 nm の溝の深さで隆起が作成されました。発達中の神経突起は、70 nm ほどの小さな特徴との接触誘導を示し、90% を超える神経突起が隆起と溝との平行配列から 10 度以内にありました。 ^[27]使用した特徴のサイズに関して、方向に大きな違いはありませんでした。細胞あたりの神経突起の数は隆起と溝によって制限され、分岐表現型ではなく双極性表現型が生成されました。 ^[27]

不規則なトポグラフィーは、通常、他の処理中に自発的に発生するプロセスによって作成されます。パターンは方向と構成がランダムで、特徴の形状は不正確またはまったく制御されません。^[7]不規則なトポグラフィーを規則的なトポグラフィーよりも作成する利点は、プロセスにかかる時間が短く、費用が安く、高度なスキルと経験を必要としないことです。不規則なトポグラフィーは、ポリマーの分離、コロイドリソグラフィー、化学エッチングによって作成できます。

ポリマー分離では、ポリマーブレンドが自発的に相分離を起こします。これは、シリコンウェーハへのスピンキャストなどの条件下でよく発生します。この方法で作成できる特徴には、ナノスケールのピット、アイランド、リボンなどがあり、ポリマーの比率と濃度を調整して特徴の形状とサイズを変更することで、ある程度制御できます。^{[7]特徴の垂直方向は正確に制御できますが、水平方向の制御はあまりありません。パターンは水平方向に非常に無秩序であるため、この方法は特定の高さの}ナノトポグラフィーと細胞の相互作用を研究するためにのみ使用できます。^[7]

コロイドリソグラフィーは安価で、高さと直径を制御した表面を作成するために使用できます。ナノコロイドは、材料表面に沿って広げることでエッチングマスクとして使用され、次にイオンビーム衝撃またはフィルム蒸発を使用してナノコロイドの周囲をエッチングし、それぞれナノコラムとナノピットを作成します。最終的な表面構造は、コロイドで覆われた領域とコロイドのサイズを変更することで制御できます。コロイドで覆われた領域は、コロイド溶液のイオン強度を変更することで変更できます。この技術は、組織工学アプリケーションに必要な大きなパターン化された表面領域を作成できます。^[7]

化学エッチングでは、材料の表面をフッ化水素酸 (HF) や水酸化ナトリウム (NaOH) などのエッチング液に浸し、ナノメートル スケールのピットや突起によって表面が所望の粗さになるまでエッチングします。 ^[7]エッチング時間が長くなると、表面は粗くなります (つまり、表面のピットや突起が小さくなります)。この基本的な方法では、表面粗さを変えるための表面処理としか考えられないため、特定の形状や組織を持つ構造を作成することはできません。この方法の大きな利点は、ナノトポグラフィーを持つ表面を作成するための使いやすさと低コストです。シリコンウェハーを HF を使用してエッチングしたところ、特定の粗さの範囲 (20～50 nm) でのみ細胞接着が強化されることが実証されました。 ^[7]

物理的な手がかりで地形を作成するだけでなく、基板の表面にポリマー溶液をパターン状に選択的に堆積させることで、化学的な手がかりで地形を作成することもできます。化学的な手がかりを堆積させる方法はいくつかあります。化学溶液を分配する 2 つの方法には、ストライプ パターン形成と圧電マイクロディスペンシングがあります。

ストライプパターンのポリマーフィルムは、希釈したポリマー溶液をキャストすることによって固体基板上に形成することができる。この方法は比較的簡単で安価であり、使用できる足場材料に制限はない。この手順では、ポリマー溶液で満たされた狭い隙間によって垂直方向に分離されたまま、ガラス板を水平方向に重ねる。上部のプレートは、60〜100 μm/s の一定速度で移動する。^[28]溶媒が蒸発すると、スライドガラスの端に溶液の薄い液膜が連続的に形成される。60、70、100 μm/s の速度で作成されたストライプパターンでは、幅と溝の間隔がそれぞれ 2.2 と 6.1 μm、3.6 と 8.4 μm、4.3 と 12.7 μm になり、隆起の高さの範囲は 50〜100 nm であった。^[28] Tsuruma、Tanaka et al.ポリ-L-リジンを塗布したフィルム上で培養された胎児神経細胞は、狭いパターン幅と間隔（幅：2.2μm、間隔：6.1μm）のポリ（ε-カプロラクトン）/クロロホルム溶液（1g / L）のストライプに付着して平行に伸長することが実証されました。^[28]しかし、ニューロンは、広い幅と間隔（幅：4.3μm、間隔：12.7μm）のパターンの軸を横切って成長しました。平均して、ストライプパターンのフィルム上のニューロンは、パターンのないフィルム上のニューロンと比較して、細胞あたりのニューライトが少なく、ニューライトが長かったです。したがって、ストライプパターンのパラメータは、成長方向、ニューライトの長さ、および細胞あたりのニューライトの数を決定することができます。^[28]

マイクロディスペンシングは、粘着性のラミニンと非粘着性のウシ血清アルブミン（BSA）溶液の液滴を分注することにより、ポリスチレン培養皿上にマイクロパターンを作成するために使用されました。[ ^29]マイクロディスペンサーは、シリコンにエッチングされたチャネルの上にあるプッシュバーに取り付けられた圧電素子で、両端に1つの入口があり、中央にノズルがあります。電圧が印加されると圧電素子が膨張し、液体がノズルから分注されます。マイクロディスペンサーは、コンピューター制御のxyテーブルを使用して移動します。マイクロパターンの解像度は、分注された液体の粘度、液滴ピッチ（線または配列内の隣接する2つの液滴の中心間の距離）、および基板など、多くの要因によって異なります。^[29]粘度が高くなると線は細くなりますが、液体の粘度が高すぎると液体を排出できません。溶液を加熱すると、より均一なタンパク質の線が作成されます。連続した線を作成するにはある程度の液滴の重なりが必要ですが、蒸発が不均一な場合は線に沿ってタンパク質濃度が不均一になる可能性があります。これは、分配された溶液の特性を変更して蒸発をスムーズにすることで防ぐことができます。

0.5 mg/mL ラミニンを含むパターンでは、マイクロディスペンスされたライン上よりもライン間の方が神経突起の成長率が高くなりました。^[29] 10 mg/mL および 1 mg/mL BSA タンパク質パターン、および脂肪酸を含まない BSA タンパク質パターンでは、かなりの数の神経突起がタンパク質ラインを避けてライン間で成長しました。したがって、脂肪酸を含む BSA ラインは、脂肪酸を含む BSA を含むラインと同様に神経突起の成長を許容しませんでした。マイクロディスペンシングは基板表面との直接接触を必要としないため、この技術では、接触によって破壊される可能性のある繊細なマイクロまたはナノトポロジーの表面を利用できます。滴を増減することで、堆積するタンパク質の量を変えることができます。マイクロディスペンシングの利点は、パターンを 5～10 分ですばやく作成できることです。圧電マイクロディスペンサーは加熱を必要としないため、熱に敏感なタンパク質や液体、および生細胞をディスペンスできます。^[29]

足場材料の選択は、おそらく最も重要な決定事項です。足場材料は生体適合性があり、生分解性でなければなりません。さらに、必要な物理的、化学的、または生物学的な手がかりを組み込むことができなければなりません。これは、一部の化学的手がかりの場合、ペプチドやその他の分子を化学的に結合できる場所がなければならないことを意味します。神経誘導導管に選択される足場材料は、ほとんどの場合、ハイドロゲルです。ハイドロゲルは、生物学的ポリマーまたは合成ポリマーのいずれかで構成されます。生物学的ポリマーと合成ポリマーの両方に長所と短所があります。導管材料は、(1) 分解および吸収速度が組織形成速度と一致しない場合、(2) 応力-ひずみ特性が神経組織のものとよく比較にならない場合、(3) 分解性腫脹が発生して著しい変形を引き起こす場合、(4) 大きな炎症反応が誘発される場合、または (5) 材料の透過性が低い場合に、不十分な回復を引き起こす可能性があることに注意することが重要です。^[30]

ハイドロゲルは、化学的または物理的に架橋された水溶性ポリマーである生体材料の一種です。化学的性質によって分解性または非分解性のいずれかになりますが、可能な限り分解性であることが望ましいです。ハイドロゲルは一般に高い生体適合性、軟組織に似た機械的特性、ゲル化する液体として注入できる能力を備えているため、組織工学の目的で大きな関心を集めています。^[4]ハイドロゲルが物理的に架橋されている場合、ゲル化には相分離に頼る必要があります。相分離は温度に依存し、可逆的です。^[4]ハイドロゲルのその他の利点としては、無毒の水性溶媒のみを使用すること、栄養素の注入と老廃物の排出が可能であること、細胞が自発的に集合できることなどが挙げられます。^[31]ハイドロゲルは界面張力が低いため、細胞は組織とインプラントの境界を越えて簡単に移動できます。^[9]ただし、ハイドロゲルでは、制御された細孔サイズで幅広い機械的特性や構造を形成することは困難です。^[4]

合成ポリマーは、分解性または非分解性である。神経組織工学の目的では、炎症や瘢痕などの長期的な影響が神経機能に深刻な損傷を与える可能性があるため、可能な限り分解性材料が好まれる。分解速度はポリマーの分子量、結晶度、およびグリコール酸と乳酸のサブユニットの比率に依存する。^[4]メチル基のため、乳酸はグリコール酸よりも疎水性が高く、加水分解が遅くなります。^[4]合成ポリマーは、より扱いやすい機械的特性と広範囲で制御可能な分解速度を持ち、免疫原性の懸念を排除します。^[4]現在、神経組織工学ではさまざまな合成ポリマーが使用されています。しかし、これらのポリマーの多くには、生体適合性や生体活性の欠如などの欠点があり、これらのポリマーは細胞の接着、増殖、分化を促進できません。^[32]合成導管は、1～2cm未満の非常に短い神経損傷の修復にのみ臨床的に成功しています。^[33]さらに、これらの導管による神経再生は、神経自家移植で見られる機能回復のレベルにはまだ達していません。^[30]

コラーゲンは細胞外マトリックスの主成分であり、末梢神経の支持組織に含まれています。3つのモノマーのフリーラジカル共重合によって三元共重合体（TERP）が合成され、コラーゲンと架橋されて、ハイブリッドな生物合成ハイドロゲル足場が作られました。^[15]この三元共重合体は、細胞に優しいポリマーとして知られているポリ（NIPAAM）に基づいています。TERPは、ハイドロゲルの堅牢性を高めるための架橋剤として、また、一部のアクリルオキシスクシンイミド基をペプチドまたは成長因子の-NH2基と反応させることによって、生理活性ペプチドまたは成長因子をグラフトするための部位として使用されます。^[15]コラーゲン三元共重合体（コラーゲン-TERP）ハイドロゲルには生理活性成分がないため、研究では、細胞接着特性を高めるために、ラミニンに見られる一般的な細胞接着ペプチド（YIGSR）をそれに結合させました。 ^[15]

PLGA ファミリーのポリマーには、ポリ乳酸 (PLA)、ポリグリコール酸 (PGA)、およびそれらの共重合体ポリ乳酸-グリコール酸共重合体 (PLGA) が含まれます。これら 3 つのポリマーはすべて、さまざまなデバイスでの使用が食品医薬品局によって承認されています。これらのポリマーは脆く、許容される化学修飾領域がありません。さらに、表面ではなくバルクで分解するため、スムーズで理想的な分解プロセスではありません。^[4]機能性の欠如を克服する試みとして、遊離アミンが構造に組み込まれ、ペプチドをつなぎ合わせて細胞の接着と動作を制御できるようになりました。^[4]

デキストランは細菌由来の多糖類で、通常はロイコノストックまたは連鎖球菌の特定の株の酵素によって生成されます。α-1,6結合D-グルコピラノース残基で構成されています。架橋デキストランハイドロゲルビーズは、カラムクロマトグラフィー用途やマイクロキャリア細胞培養技術用の低タンパク質結合マトリックスとして広く使用されています。^[34]しかし、デキストランハイドロゲルがバイオマテリアル用途、特に薬物送達媒体として研究されるようになったのは最近のことです。バイオマテリアル用途でデキストランを使用する利点は、タンパク質吸着および細胞接着に対する耐性であり、これにより、ECM成分から意図的に付着したペプチドによって特定の細胞接着を決定できます。^[34] AEMAは、細胞接着を促進するためにECM由来のペプチドを付着させる部位を提供するための第一級アミン基を導入するために、Dex-MAと共重合されました。ペプチドは、スルホ-SMMCカップリング化学とシステイン末端ペプチドを使用して固定化できます。Dex-MAとAEMAの共重合により、細胞相互作用を促進するだけでなく、スキャフォールドのマクロポーラス形状を維持することができました。^[34]

神経誘導導管の作成に使用するために、ポリグリセロールセバケート（PGS）から、生分解性の強靭な新しいエラストマーが開発されました。^[30] PGSはもともと、ECMの機械的特性を特に模倣する軟部組織工学の目的で開発されました。機械的に動的な環境での変形から回復し、微小応力の形で再生組織全体に応力を効果的に均等に分散できるため、エラストマーと見なされています。PGSは、グリセロールとセバシン酸の重縮合反応によって合成され、溶融処理または溶媒処理して目的の形状にすることができます。PGSのヤング率は0.28 MPaで、極限引張強度は0.5 MPaを超えています。^[30]末梢神経のヤング率は約0.45 MPaで、PGSのヤング率に非常に近いです。さらに、PGSは表面劣化を起こし、吸収中に線質量と強度が低下します。^[30]移植後、分解半減期は21日と決定され、60日目に完全に分解されました。^[30] PGSは分解中に最小限の水分吸収を経験し、検出可能な膨張はありません。膨張は歪みを引き起こし、尿細管腔を狭め、再生を妨げる可能性があります。PGSの分解時間は、架橋度とセバシン酸とグリセロールの比率を変更することで変えることができるという利点があります。^[30] Sundbackら（2005）の研究では、移植されたPGSとPLGA導管は同様の初期組織反応を示しました。しかし、PLGAの炎症反応は後に急増したのに対し、PGSの炎症反応は減少し続けました。^[30]

ポリエチレングリコール（PEG）ハイドロゲルは生体適合性があり、中枢神経系を含む多くの組織タイプで許容されることが証明されています。Mahoney と Anseth は、分解性 PEG マクロマーに共有結合したメタクリレート基を光重合して PEG ハイドロゲルを形成しました。ハイドロゲルの分解は、膨潤率データから機械的強度（圧縮弾性率）と平均メッシュサイズを測定することで、経時的に監視されました。^[35]当初、ポリマー鎖は高度に架橋されていましたが、分解が進むにつれてエステル結合が加水分解され、ゲルが膨潤しました。メッシュサイズが大きくなるにつれて圧縮弾性率は低下し、ハイドロゲルは完全に溶解しました。神経前駆細胞は、最小限の細胞死で PEG ゲル上で光カプセル化および培養できることが実証されました。メッシュサイズは最初は小さいため、ハイドロゲルは周囲の組織からの炎症性およびその他の阻害信号をブロックします。メッシュサイズが大きくなるにつれて、ハイドロゲルは軸索再生の足場として機能できるようになります。^[35]

生物由来ポリマーを合成ポリマーよりも使用する利点があります。生物由来ポリマーは何らかの形ですでに自然界に存在するため、生体適合性が高く、分解しやすい可能性が非常に高いです。しかし、欠点もいくつかあります。生物由来ポリマーは扱いにくい機械的特性と、広範囲にわたって制御できない分解速度を持っています。さらに、天然由来の材料が免疫反応を引き起こしたり、微生物を含んでいたりする可能性が常にあります。^[4]天然由来の材料の製造では、大規模な分離手順でバッチ間の変動も発生し、これは制御できません。^[16]天然ポリマーを悩ませている他のいくつかの問題は、崩壊、瘢痕形成、および早期の再吸収の可能性があるため、長い病変の隙間を越えた成長をサポートできないことです。^[16]これらの欠点のいくつかは克服できますが、それでも生物由来ポリマーは多くの状況で依然として最適な選択であることが証明されています。

ポリシアリン酸（PSA）は、人工神経導管用の比較的新しい生体適合性かつ生体吸収性の材料です。これは、α2,8結合シアリン酸残基のホモポリマーであり、神経細胞接着分子（NCAM）の動的に調節された翻訳後修飾です。最近の研究では、ポリシアリル化NCAM（ポリシア-NCAM）が運動系の再生を促進することが実証されています。^[36] PSAは細胞培養条件下で安定しており、酵素による分解を誘導します。また、PSAが神経突起形成、軸索経路探索、神経芽細胞の移動などのステアリングプロセスに関与していることも最近発見されました。^[36] PSAを遺伝子ノックアウトした動物は、経路探索に失敗する致死的な表現型を発現し、2つの脳半球を接続する神経が異常または欠損しています。^[36]したがって、PSAは適切な神経系の発達に不可欠です。

コラーゲンは細胞外マトリックスの主成分であり、神経の再生と修復に広く使用されています。コラーゲンゲルは滑らかな微細構造と透過性を備えているため、分子の拡散が可能です。コラーゲンの再吸収速度は、コラーゲンをポリポキシ化合物で架橋することで制御できます。^[6]さらに、コラーゲンI/III型スキャフォールドは優れた生体適合性を示し、シュワン細胞の増殖を促進します。しかし、ラットの神経ギャップを埋めるために使用されたシュワン細胞で満たされたコラーゲン導管は、神経自家移植片と比較して、驚くほど神経再生がうまくいきませんでした。^[6]これは、生体適合性は神経再生を成功させるために必要な唯一の要因ではないためです。これらのコラーゲンI/IIIゲルによって得られる結果を改善するには、内径、内部の微細構造、多孔性、壁の厚さ、シュワン細胞の播種密度などの他のパラメータを今後の研究で調べる必要があります。^[6]

クモ糸繊維は細胞の接着、増殖、活力を促進することが示されています。Allmeling、Jokusziesらは、シュワン細胞が絹繊維に素早くしっかりと付着し、双極形状に成長することを示しました。絹繊維上での増殖率と生存率は正常でした。^[37]

彼らはクモ糸繊維を使って、シュワン細胞と無細胞化した異種静脈を含む神経導管を作った。シュワン細胞は短時間で糸繊維に沿って柱を形成し、その柱は末梢神経系の損傷後に体内で成長するブングナー線維に似ていた。^[37]クモの捕食性と個々のクモからの糸の収量が少ないため、クモ糸はこれまで組織工学に使用されてこなかった。Nephila clavipes という種が作る糸はカイコ糸よりも免疫原性が低いことが発見されており、その引張強度は 4 x 109 N/m で、これは鋼鉄の破断強度の 6 倍である。^[37]クモ糸はタンパク質分解によって分解されるため、分解中に pH が生理学的 pH から変化しない。クモ糸の他の利点としては、数週間にわたって真菌や細菌による分解に耐えることや、膨張しないことなどが挙げられる。また、糸の構造は細胞の接着と移動を促進する。しかし、クモ糸の採取は依然として面倒な作業であり、正確な組成は種によって異なり、同じ種でも食事や環境によって個体によっても異なります。クモ糸を合成して製造する試みは行われてきました。クモ糸の神経導管をin vitroおよびin vivoで使用する実現可能性をテストするには、さらなる研究が必要です。^[37]

クモに加えて、カイコもシルクの供給源です。カイコガのタンパク質はフィブロインタンパク質の核で、その周囲をセリシンが取り囲んでいます。セリシンは接着剤のようなタンパク質のファミリーです。フィブロインは、疎水性で結晶化可能な配列 Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-X (X は Ser または Tyr の略) を繰り返した重鎖として特徴付けられています。周囲のセリシンは極性残基が多いため親水性が高くなりますが、それでも疎水性の β シート部分が残っています。シルクは、その高い機械的強度と柔軟性、および水と酸素の透過性のため、長い間縫合糸として使用されてきました。さらに、シルクフィブロインは簡単に操作でき、滅菌することもできます。しかし、望ましくない免疫学的反応が報告されたため、シルクの使用は中止されました。最近、免疫学的問題の原因は周囲のセリシンだけにあることが発見されました。^[38]この発見以来、セリシンを除去したシルクは多くの医薬品やバイオメディカル用途に使用されています。シルクを使用する前にフィブロインの周囲からセリシンを除去する必要があるため、その効率的な除去方法を開発する必要があり、これは脱ガムと呼ばれます。脱ガム法の1つは、沸騰したNa ₂ CO ₃水溶液を使用し、フィブロインを損傷することなくセリシンを除去します。ヤン、チェンらは、シルクフィブロインとシルクフィブロイン抽出液はシュワン細胞との良好な生体適合性を示し、増殖に対する細胞毒性効果がないことを証明しました。^[38]

キトサンとキチンは、 β（1-4）結合したN-アセチル-D-グルコサミンとD-グルコサミンサブユニットからなるバイオポリマーのファミリーに属します。^[39]キトサンは、セルロースに次いで2番目に豊富な天然ポリマーであるキチンのアルカ​​リN-脱アセチル化によって形成されます。^[14]キトサンは、キレート剤、薬物キャリア、膜、水処理添加剤など、多くの生物医学的用途で有用な生分解性多糖類です。^[11]キトサンは希薄水溶液に溶けますが、中性pHではゲルに沈殿します。^[11]神経細胞の接着と増殖を十分にサポートしませんが、ECM由来のペプチド接着によって強化できます。キトサンには弱い機械的特性もあり、これを克服するのはより困難です。^[9]

可溶性キトサンのアセチル化度（DA）は、処理条件に応じて0％から60％の範囲です。^[39] DAの変化がキトサンの特性にどのように影響するかを特徴付ける研究が行われました。DAの変化は、無水酢酸またはアルカリ加水分解を使用して得られました。アセチル化を低下させると、圧縮強度が増加することがわかりました。^{[39]生分解は、グリコシド結合を加水分解することでキトサンを}体内で分解する主な原因であることが知られており、神経損傷後に貪食細胞によって放出されます。結果は、研究期間中、高DAおよび低DAと比較して、中DAで加速された質量損失があったことを明らかにしました。^[39] DRG細胞をN-アセチル化キトサン上で増殖させたところ、細胞生存率はDAの増加とともに低下しました。また、キトサンはDAの減少とともに電荷密度が増加し、それが細胞接着の増加に寄与しています。^[39]したがって、キトサンのDAを制御することは、分解時間を調節するために重要であり、この知識はキトサンからの神経誘導導管の開発に役立つ可能性がある。

最近、アラゴナイトスキャフォールドがラット海馬のニューロンの成長をサポートすることが示されました。Shany ら (2006) は、アラゴナイト マトリックスがin vitroおよびin vivoでアストロサイト ネットワークの成長をサポートできることを証明しました。したがって、アラゴナイト スキャフォールドは神経組織の修復と再生に有用である可能性があります。アラゴナイト由来の Ca ^{2+ は}、細胞接着と細胞間接触を促進するために不可欠であると仮定されています。これはおそらく、カドヘリンなどのCa ^{2+依存性接着分子の助けを借りて行われます。 [40]}アラゴナイト結晶マトリックスには、ハイドロゲルに比べて多くの利点があります。より大きな細孔があるため、細胞の成長が向上し、Ca ^{2+ を}放出することで材料が生物活性になり、細胞の接着と生存が促進されます。さらに、アラゴナイト マトリックスはハイドロゲルよりも機械的強度が高く、損傷した組織に押し込んだときにより大きな圧力に耐えることができます。^[40]

アルギン酸は容易に鎖を形成する多糖類であり、カルボキシル基で Cu ²⁺、Ca ²⁺、または Al ³⁺などの多価カチオンと架橋して、より機械的に安定したハイドロゲルを形成することができる。^[41]アルギン酸カルシウムは、生体適合性と非免疫原性の両方を備えたポリマーを形成し、組織工学用途に使用されている。しかし、それらは、近位端をその標的と再接続するために必要な、縦方向の成長をサポートすることができない。この問題を克服するために、異方性毛細管ハイドロゲル (ACH) が開発された。それらは、アルギン酸ナトリウムの水溶液と多価カチオンの水溶液を層状に重ねることによって作成される。^[41]形成後、電解質イオンはポリマー溶液層に拡散し、散逸対流プロセスによってイオンが沈殿し、毛細管が形成される。散逸対流プロセスは、拡散勾配の反対とポリ電解質鎖間の摩擦をもたらす。^[41]毛細血管の壁は沈殿した金属アルギン酸塩で覆われ、内腔は押し出された水で満たされています。

Prang et al. (2006) は、損傷した哺乳類の CNS における方向性のある軸索再生を促進する ACH ゲルの能力を評価しました。アルギン酸ベースの ACH ゲルを作成するために使用された多価イオンは銅イオンであり、これがアルギン酸ナトリウム層に拡散して六角形構造の異方性毛細管ゲルを作成しました。^[41]沈殿後、縦方向に配向した毛細管がゲル全体を横断しました。ACH スキャフォールドは、成体 NPC の生存と高度に配向した軸索再生を促進しました。^[41]これは、アルギン酸を使用して異方性構造の毛細管ゲルを生成した最初の例です。CNS 軸索再生には何ヶ月もかかることがあるため、今後の研究では ACH スキャフォールドの長期的な物理的安定性を調査する必要がありますが、スキャフォールドは長期的なサポートを提供できるだけでなく、分解可能でなければなりません。Prang et al. が調査したすべての生物学的および合成バイオポリマーの中で、 （2006）では、アガロースベースのゲルのみがACHスキャフォールドによる線状再生と比較することができた。今後の研究では、ACHスキャフォールドが脊髄損傷後の生体内での標的の再神経支配を可能にするかどうかも調査する必要がある。 ^[41]

ヒアルロン酸（HA）は、その優れた生体適合性と生理機能の多様性から、広く使用されている生体材料です。ヒアルロン酸は細胞外マトリックス（ECM）に豊富に存在し、特定のHA-タンパク質相互作用を介して大きなグリコサミノグリカン（GAG）およびプロテオグリカンに結合します。また、HAはCD44などの細胞表面受容体に結合し、細胞接着と運動性を制御し、増殖と分化を促進する細胞内シグナル伝達カスケードを活性化します。^[42] HAは、その分解産物が内皮細胞の増殖と移動を刺激するため、血管新生をサポートすることも知られています。このように、HAは組織の生存に必要な正常なプロセスを維持する上で極めて重要な役割を果たしています。未修飾のHAは、眼科手術、創傷治癒、形成外科などの臨床用途に使用されています。^[42] HAは架橋してハイドロゲルを形成できます。 Houらによる研究では、未修飾またはラミニン修飾のHAハイドロゲルを成人の中枢神経系病変に移植し、神経組織形成を誘導する能力をテストしました。グリア瘢痕形成を阻害するだけでなく、細胞の成長と血管新生をサポートする能力が実証されました。また、ラミニン修飾HAハイドロゲルは神経突起の伸展を促進することができました。^[42]これらの結果は、HAゲルが神経誘導導管用の有望な生体材料であることを裏付けています。

足場材料と物理的手がかりに加えて、生物学的手がかりも細胞の形でバイオ人工神経導管に組み込むことができます。神経系には、ニューロンの成長と維持をサポートするさまざまな種類の細胞があります。これらの細胞は、総称してグリア細胞と呼ばれます。グリア細胞は、軸索再生を促進する能力の背後にあるメカニズムを理解するために研究されてきました。シュワン細胞、アストロサイト、嗅覚鞘細胞の 3 種類のグリア細胞について説明します。グリア細胞に加えて、幹細胞も、ニューロンまたはグリア細胞に分化できるため、修復と再生に潜在的な利点があります。この記事では、成体、分化転換間葉系、外胚葉系間葉系、神経系、神経前駆幹細胞の使用について簡単に説明します。

グリア細胞は、末梢神経系と中枢神経系のニューロンの成長と維持をサポートするために必要です。ほとんどのグリア細胞は、末梢神経系または中枢神経系に特有です。シュワン細胞は末梢神経系にあり、ニューロンの軸索を髄鞘化します。アストロサイトは中枢神経系に特有で、ニューロンに栄養、物理的サポート、絶縁を提供します。また、血液脳関門を形成します。しかし、嗅覚鞘細胞は嗅覚受容体ニューロンを PNS から CNS に導くため、CNS-PNS 境界を越えます。

シュワン細胞（SC）は末梢神経の再生に不可欠であり、構造的および機能的役割を果たします。シュワン細胞は、ワラー変性とバングナー帯の両方に関与しています。末梢神経が損傷すると、シュワン細胞は形態、行動、増殖を変化させ、ワラー変性とバングナー帯に関与するようになります。 ^[38]ワラー変性では、シュワン細胞は神経内膜管に沿って整然とした列状に成長し、神経内膜チャネルを保護して保存するバングナー帯（boB）を形成します。さらに、シュワン細胞はマクロファージと連携して再生を促進する神経栄養因子を放出します。神経組織工学でシュワン細胞を使用することにはいくつかの欠点があります。たとえば、シュワン細胞を選択的に分離することは困難であり、いったん分離すると増殖が乏しくなります。この困難を克服する1つの方法は、幹細胞などの他の細胞を人工的にSCのような表現型に誘導することです。^[43]

江口ら（2003）は、シュワン細胞を整列させるために磁場を利用することを研究した。彼らは、中心に8テスラの磁場を発生させる水平型超伝導磁石を使用した。60時間の曝露で、シュワン細胞は磁場と平行に整列した。同じ期間、曝露されていないシュワン細胞はランダムに配向した。膜成分と細胞骨格要素の磁場感受性の差が、磁場配向の原因ではないかと仮説が立てられている。^[44]コラーゲン繊維も磁場に曝露され、2時間以内に磁場に対して垂直に整列したが、磁場曝露がないコラーゲン繊維はランダムな網目模様を形成した。コラーゲン繊維上で培養すると、8テスラの磁場に2時間曝露した後、シュワン細胞は磁気配向したコラーゲンに沿って整列した。対照的に、シュワン細胞は磁場曝露がないコラーゲン繊維上でランダムに配向した。このように、コラーゲン繊維上で培養すると、シュワン細胞は磁場に対して垂直に配向し、配向がはるかに速くなった。^[44]

これらの発見は、神経系損傷におけるシュワン細胞を整列させて、再生する軸索を標的に戻す神経内膜管を維持するために重要なブングナー帯の形成を促進するのに役立つ可能性があります。外部の物理的技術でシュワン細胞を整列させることはほぼ不可能であるため、整列のための代替技術の発見は重要です。ただし、開発された技術には、磁場を長時間維持するためにかなりのエネルギーが必要になるという欠点がまだあります。

シュワン細胞の移動能力を高めるための研究が行われてきた。シュワン細胞の移動は、フィブロネクチンやラミニンなどのECM分子とのインテグリンによって制御されている。さらに、神経細胞接着分子（NCAM ）は、試験管内でシュワン細胞の運動性を高めることが知られている。^[45] NCAMは、軸索とシュワン細胞膜に発現する糖タンパク質である。ポリシアリル酸（PSA）は、ポリシアリルトランスフェラーゼ（PST）とシアリルトランスフェラーゼX（STX）によってNCAM上で合成される。^{[45] CNSの発達中、NCAM上のPSA発現は出生後段階までアップレギュレーションされる。しかし、成人の脳では、PSAは}可塑性が高い領域にのみ見られる。PSA発現はシュワン細胞上では起こらない。

Lavdas et al. (2006) は、シュワン細胞上での PSA の持続的発現が細胞の移動を促進するかどうかを調査した。シュワン細胞は、PSA 発現を誘導するために、STX をコードするレトロウイルスベクターで形質導入された。PSA 発現シュワン細胞は、ギャップブリッジングアッセイおよび出生後前脳切片培養での移植後に実証されたように、運動性が向上した。^[45] PSA 発現は分子的および形態的分化を変化させなかった。PSA 発現シュワン細胞は、小脳切片で CNS 軸索を髄鞘化することができたが、これは通常、生体内では不可能である。これらの PSA 発現シュワン細胞は、髄鞘形成能力を失うことなく CNS 全体に移動することができ、中枢神経系の軸索の再生および髄鞘形成に役立つ可能性があると期待されている。^[45]

アストロサイトは中枢神経系に豊富に存在するグリア細胞です。ニューロンの代謝と栄養のサポートに不可欠です。さらに、アストロサイトはイオン緩衝作用と神経伝達物質の除去も行います。成長中の軸索はアストロサイトが作り出す合図によって誘導されるため、アストロサイトは神経突起の経路探索と、その後の発達中の脳のパターン形成を制御できます。^[40]中枢神経系の損傷後に形成されるグリア瘢痕は、アストロサイトと線維芽細胞によって形成され、再生にとって最も大きな障害となります。グリア瘢痕は、肥大したアストロサイト、結合組織、および ECM で構成されています。神経組織工学の 2 つの目標は、アストロサイトの機能を理解し、アストロサイトの成長を制御することです。Shany ら (2006) の研究では、従来の 2D 細胞培養と比較して、3D アラゴナイト マトリックス上でアストロサイトの生存率が向上することが実証されています。細胞突起が曲線や孔を越えて伸びる能力により、複雑な 3D 構成を持つ複数の細胞層の形成が可能になります。

細胞が3D形状を獲得した3つの異なる方法は次のとおりです。^[40]

1. 表面に密着し、3D輪郭に沿って
2. 2つの曲率間のいくつかのプロセスを伸ばす
3. 多層組織内に位置する場合、細胞層内で3Dにプロセスを拡張する

従来の細胞培養では、成長は1つの平面に限定され、ほとんどの細胞が表面に接触する単層形成を引き起こします。しかし、アラゴナイト表面の3D曲率により、複数の層が発達し、遠く離れたアストロサイトが互いに接触することができます。アストロサイトの突起形態は再生軸索の方向性を導く上で不可欠であるため、 3Dの生体内条件に似た突起形成を促進することが重要です。 ^[40]アラゴナイトの地形は、表面積と体積の比が高く、エッジがないため、培養エッジ効果が減少します。^{[40]ここで述べたアラゴナイトなどの結晶性マトリックスは、}生体内条件に近い複雑な3D組織形成を促進することができます。

哺乳類の一次嗅覚系は、成体になっても継続的に再生する能力を保持している。^[46] 嗅覚受容ニューロンの平均寿命は6～8週間であるため、上皮基底部の近くの層内にある幹細胞から分化した細胞に置き換えられる必要がある。新しい嗅覚受容ニューロンが機能するには、中枢神経系を介して嗅球に軸索を投射する必要がある。軸索の成長は、嗅球のグリア細胞の構成と細胞構造、および嗅球鞘細胞（OEC）の存在によって左右される。^[46]

OEC は嗅板に由来すると仮定されており、他の同様の神経系ミクログリアとは異なる発達の起源を示唆しています。

もう一つの興味深い概念は、OECが一次嗅覚系の末梢神経系と中枢神経系の両方、つまり嗅上皮と嗅球に存在するというものである。^[46]

OECは、損傷後に低親和性NGF受容体p75の上方制御をもたらすという点でシュワン細胞に似ていますが、シュワン細胞とは異なり、神経栄養因子の産生レベルは低くなります。いくつかの研究では、OECが損傷した軸索の再生をサポートできるという証拠が示されていますが、これらの結果は再現できないことがよくあります。^{[46]とにかく、OECは脊髄損傷、}筋萎縮性側索硬化症、およびその他の神経変性疾患 との関連で徹底的に調査されてきました。研究者は、これらの細胞が損傷したニューロンを再髄鞘化する独自の能力を持っていることを示唆しています。^[47]

OECはアストロサイトと類似した性質を持っており^[48]、どちらもウイルス感染の影響を受けやすいことが確認されている。^{[47] [48]}

幹細胞は、長期間自己複製する能力と、1つまたは複数の細胞系統に沿って分化する能力を維持する能力を特徴とする。幹細胞は、単能性、多能性、または多能性であり、それぞれ1つ、複数、またはすべての細胞タイプに分化できることを意味する。^[49]多能性幹細胞は、3つの胚性胚葉のいずれかに由来する細胞になることができる。^[49]幹細胞は、培養でより容易に増殖することができるため、グリア細胞よりも優れている。しかし、これらの細胞を秩序だった方法でさまざまな細胞タイプに優先的に分化させることは依然として困難である。^[4]幹細胞のもう1つの困難は、造血幹細胞（HSC）を超える幹細胞の明確な定義がないことである。各幹細胞「タイプ」には、細胞を識別、分離、および増殖するための複数の方法があります。これは大きな混乱を引き起こしました。なぜなら、ある「タイプ」（神経、間葉、網膜）のすべての幹細胞が、必ずしも同一の条件下で同じように動作するとは限らないからです。

成体幹細胞は、生体内ほど効果的に増殖および分化することができない。成体幹細胞はさまざまな組織の部位から得られるが、表面マーカーではなく挙動によって定義されるため、分離することは困難である。幹細胞とその周囲の分化細胞を明確に区別する方法はまだ開発されていない。しかし、表面マーカーは、不要な分化細胞のほとんどを除去するためにある程度使用できる。幹細胞の可塑性とは、胚性生殖系列の境界を越えて分化する能力である。しかし、可塑性の存在については激しい論争が繰り広げられてきた。可塑性は細胞間の異質性または細胞融合イベントによって引き起こされると主張する人もいる。現在、細胞は細胞株を越えて分化することができ、その収率は使用する技術に応じて10％から90％の範囲である。^[49]分化転換による収率を標準化するには、さらに研究を行う必要がある。多能性幹細胞の分化転換は、成人では入手できない、または入手しにくい幹細胞を得るための潜在的な手段である。^[4]

間葉系幹細胞は骨髄に存在する成体幹細胞であり、中胚葉起源の系統に分化することができる。それらが形成する組織の例としては、骨、軟骨、脂肪、腱などがある。MSCは骨髄を吸引することで得られる。血小板由来成長因子、上皮成長因子β、インスリン様成長因子-1など、多くの因子がMSCの成長を促進する。通常の分化経路に加えて、MSCはアストロサイト、ニューロン、末梢神経系髄鞘形成細胞などの非間葉系系統に沿って分化転換することができる。MSCは、以下の理由から神経再生戦略に潜在的に有用である。^[50]

1. それらの使用は倫理的な問題ではない
2. 免疫抑制は必要ありません
3. それらは豊富でアクセス可能なリソースである
4. 彼らは遺伝子操作を容認している

Keilhoff ら (2006) は、ラットの坐骨神経の 2 cm の隙間を埋める失活筋移植片において、未分化および分化 MSC の神経再生能力をシュワン細胞と比較する研究を行った。すべての細胞は自己由来であった。分化 MSC は、シュワン細胞様細胞の形成を促進するために、因子の混合物中で培養された。未分化 MSC は再生能力を示さなかったが、分化 MSC は、シュワン細胞の能力には及ばないものの、ある程度の再生能力を示した。^[50]

シュワン細胞を単離し、続いて増殖を誘導することが難しいことが大きな障害となっている。解決策としては、外胚葉系幹細胞（EMSC）などの細胞をシュワン細胞様表現型に選択的に誘導することがあげられる。EMSCは、末梢神経系の初期発達中に頭蓋神経堤から第一鰓弓に移動する神経堤細胞である。^{[43] EMSCは}多能性があり、自己複製能力を持っている。これらは、背根神経節と運動神経の発達に関連しているため、シュワン前駆細胞と考えることができる。EMSCの分化は、固有の遺伝プログラムと周囲の環境の細胞外シグナルによって制御されていると思われる。^{[43]シュワン細胞は、神経の再生に不可欠な神経栄養因子と}神経栄養因子の両方の供給源であり、成長を導く足場である。Nie、Zhang et al. PLGA導管内でEMSCを培養する利点を調査する研究が行われた。EMSC培養にフォスコリンとBPEを添加すると、in vitroのシュワン細胞に共通する細長い細胞突起の形成が引き起こされた。^[43]したがって、フォスコリンとBPFはシュワン細胞のような表現型への分化を誘導する可能性がある。BPEには、 MAPキナーゼを活性化することでグリア細胞とシュワン細胞の分化と増殖を引き起こすサイトカインGDNF、塩基性線維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子が含まれている。PLGA導管に移植されたEMSCは長期生存を維持し、通常はほとんどまたは全く再生を示さない10 mmのギャップ全体で末梢神経の再生を促進した。移植片内には髄鞘形成軸索が存在し、髄鞘内に基底膜が形成された。これらの観察結果は、EMSC が導管内の再生神経線維の髄鞘形成を促進する可能性があることを示唆しています。

ニューロンをバイオ人工神経導管に挿入することは、損傷した神経を置き換える最も明白な方法のように思えますが、ニューロンは増殖できず、培養すると短命になることがよくあります。したがって、神経前駆細胞は自己再生性があり、最小限のドナー材料で多くの細胞をin vitroで生成できるため、損傷したニューロンや変性したニューロンを置き換えるためのより有望な候補です。 ^[31]神経前駆細胞から形成された新しいニューロンが機能ネットワークの一部であることを確認するには、シナプス形成の存在が必要です。Ma、Fitzgeraldらによる研究は、3Dコラーゲンマトリックス上でのマウス神経幹および前駆細胞由来の機能的シナプスおよび神経ネットワーク形成を初めて実証したものです。神経前駆細胞は増殖し、自発的に興奮性ニューロンに分化してシナプスを形成しました。さらに、それらは3つの神経組織系統に分化する能力を保持していました。^[31]また、活発なシナプス小胞のリサイクルが起こっただけでなく、自発的に活動電位を生成できる興奮性および抑制性接続も形成されたことが実証されました。^[31]したがって、神経前駆細胞は機能的なニューロンを作成するための実行可能で比較的無制限のソースです。

神経幹細胞（NSC）は、自己複製能とニューロン系およびグリア系に分化する能力を有する。NSCの分化を誘導するための培養法は数多く開発されているが、NSCの分化を誘導するための生体材料の創出は、より臨床的に関連性があり使用可能な技術と考えられている。^[要出典] NSCの分化を誘導するための生体材料を開発する1つの方法は、細胞外マトリックス（ECM）成分と成長因子を組み合わせることである。Nakajima、Ishimuroらによるごく最近の研究では、成長因子とECM成分からなるさまざまな分子ペアが、NSCのアストロサイトとニューロン細胞への分化に及ぼす影響を検討した。調査したECM成分は、天然のECM成分であるラミニン1とフィブロネクチン、人工のECM成分であるProNectin F plus（Pro-F）とProNectin L（Pro-L）、およびポリ（エチレンイミン）（PEI）であった。使用した神経栄養因子は、上皮成長因子（EGF）、線維芽細胞成長因子-2（FGF-2）、神経成長因子（NGF）、ニューロトロフィン-3（NT-3）、および毛様体神経栄養因子（CNTF）でした。これらの組み合わせをマトリックス細胞アレイ上に固定化し、その上でNSCを培養しました。培養2日後、細胞は、それぞれNSC、神経細胞、およびアストロサイトのマーカーであるネスチン、β-チューブリンIII、およびGFAPに対する抗体で染色されました。 ^[51]この結果は、NSCの分化を誘導する生体材料を開発するための実用的な方法として、ECM成分と成長因子の有利な組み合わせに関する貴重な情報を提供します。^[51]

現在、神経栄養因子は生体内で軸索の成長と再生を導くために必要であるため、バイオ人工神経導管での使用について集中的に研究されています。研究では、神経栄養因子は通常、細胞や特定の地形の追加によって作成される生物学的および物理的キューなどの他の技術と組み合わせて使用​​されます。神経栄養因子は足場構造に固定されていてもいなくてもかまいませんが、固定されている方が、永続的で制御可能な勾配を作成できるため好まれます。神経ドラッグデリバリーシステムなどの一部のケースでは、神経栄養因子は緩く固定されており、特定の時間に特定の量で選択的に放出されます。ドラッグデリバリーは、神経誘導導管への成長因子の基本的な追加を超えた次のステップです。

神経誘導導管に使用される多くの生体材料は生体模倣材料である。生体模倣材料は、ECMタンパク質からの足場結合ペプチドとの相互作用によって媒介される特定の細胞応答を誘発するように設計された材料であり、本質的には化学的または物理的修飾によって生体材料に細胞結合ペプチドを組み込むことである。^[52]

相乗効果は、2 つの要素が組み合わされたときによく発生します。2 つの要素間の相互作用により、各要素を個別に組み合わせた場合よりも大きな効果が得られます。足場材料と地形を細胞療法、神経栄養因子、生体模倣材料と組み合わせると、相乗効果が顕著になります。相乗効果の調査は、個々の技術が単独で成功することが証明された後の次のステップです。相乗効果を最適化するには、これらのさまざまな要素の組み合わせを慎重に研究する必要があります。

神経栄養因子間の相互作用が各因子の最適濃度を変える可能性があるという仮説が立てられた。細胞の生存と表現型の維持は重要であるが、評価では神経突起の伸長に重点が置かれた。NGF、グリア細胞株由来神経栄養因子（GDNF）、および毛様体神経栄養因子（CNTF）の組み合わせが、 in vitroで背根神経節培養に提示された。各神経栄養ファミリーから1つの因子が使用された。^[53]個々の最適濃度と組み合わせの最適濃度に違いはないことが判明したが、5日目または6日目頃に神経突起の伸長が停止し、分解し始めた。これは、重要な栄養素または適切な勾配の欠如が原因であると考えられた。これまでの研究では、成長因子は勾配で提示された場合に神経突起の伸長を最も最適化できることが示されている。^[53]神経栄養因子の組み合わせに関する将来の研究では、勾配を含める必要がある。

細胞接着分子（CAM）と神経栄養因子を生体適合性マトリックスに一緒に埋め込むという比較的新しい概念が研究されています。^{[54] L1/NgCAMとニューロファシンを含む}免疫グロブリンスーパーファミリー（IgSF）のCAMは、発達中の神経系のニューロンまたはシュワン細胞で発現するため、特に有望です。これらは誘導キューとして機能し、ニューロンの分化を媒介することが知られています。しかし、NGFや成長分化因子5（GDF-5）などの神経栄養因子は、生体内での再生促進剤として十分に確立されています。Niere、Brownらによる最近の研究では、培養されたDRGニューロンに対するL1とニューロファシンをNGFとGDF-5と組み合わせた場合の相乗効果を調査しました。この組み合わせにより、神経突起の成長が促進されました。L1とニューロファシンを人工融合タンパク質に組み合わせることで、因子が個別に送達されないため効率が向上することが実証されました。^[54]異なるキューを使用できるだけでなく、それらを1つの「新しい」キューに融合することもできます。

化学的、物理的、生物学的な刺激など、複数の刺激タイプを提示することによる神経前駆細胞の分化への影響は、これまで研究されていませんでした。成体ラットの海馬前駆細胞（AHPC）に3つの異なる刺激、すなわち出生後ラット1型アストロサイト（生物学的）、ラミニン（化学的）、およびマイクロパターン化された基質（物理的）を提示する研究が行われました。^[55]パターン化されていない基質上ではランダムに成長したのに対し、AHPCの75％以上が溝から20°以内に整列しました。^[55] AHPCをアストロサイトとともにマイクロパターン化された基質上で増殖させた場合、成長は溝に沿って整列したアストロサイトによって影響を受けました。つまり、AHPCはアストロサイトの細胞骨格フィラメントに沿って突起を伸ばしました。しかし、整列は、マイクロパターン化された基質で単独で培養されたAHPCで見られるほど顕著ではありませんでした。分化の結果として発現する異なる表現型を評価するために、細胞は、それぞれ初期ニューロン、オリゴデンドロサイト、アストロサイトのマーカーであるクラスIII β-チューブリン（TuJI）、受容体相互作用タンパク質（RIP）、グリア線維性酸性タンパク質（GFAP）に対する抗体で染色されました。最も分化が顕著だったのは、アストロサイトを含むパターン化された基質上で培養されたAHPCでした。^[55]

• ジョージア工科大学：神経工学研究所
• 神経科学学会