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モルホリノは、モルホリノオリゴマーやホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー( PMO )とも呼ばれ、分子生物学で遺伝子発現を変更するために使用されるオリゴマー 分子(口語的にはオリゴ)の一種です。その分子構造は、ホスホロジアミデート基を介して結合したメチレンモルホリン環のバックボーンに付着した DNA 塩基で構成されています。モルホリノは、リボ核酸(RNA)の塩基対形成表面の小さな (約 25 塩基) 特定の配列への他の分子のアクセスをブロックします。モルホリノは、遺伝子機能をノックダウンすることにより、逆遺伝学の研究ツールとして使用されます。
この記事では、核酸類似体であるモルフォリノアンチセンスオリゴマーについてのみ説明します。「モルフォリノ」という単語は、6員モルフォリン環を含む化学物質を指す他の化学名にも使用されることがあります。他のモルフォリン含有分子との混同を避けるために、オリゴを説明する際、「モルフォリノ」は商標名として大文字で表記されることが多いですが、この用法は科学文献全体で一貫しているわけではありません。モルフォリノオリゴは、特に医学文献では、PMO (ホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマー) と呼ばれることがあります。Vivo-モルフォリノとPPMOは、細胞への侵入を容易にするために化学基が共有結合したモルフォリノの改変型です。
遺伝子ノックダウンは、細胞内の特定の遺伝子の発現を低下させることによって達成される。タンパク質をコードする遺伝子の場合、これは通常、細胞内の対応するタンパク質の量の減少につながる。遺伝子発現のノックダウンは、特定のタンパク質の機能について知るための方法である。同様に、タンパク質をコードするRNA転写産物から特定のエクソンを切り出すと、そのエクソンによってコードされるタンパク質部分 の機能を決定するのに役立つ場合があり、場合によってはタンパク質の活性を完全にノックダウンできる。これらの分子は、マウス、ゼブラフィッシュ、カエル、ウニなど、いくつかのモデル生物の研究に適用されている。[1]モルフォリノは、プレmRNAのスプライシングを変更したり[2]、miRNAの成熟と活性を阻害したりすることもできる。 [3] モルフォリノをRNAに標的化し、細胞にモルフォリノを送達する技術は、最近、ジャーナル記事[4]と本の形でレビューされている。[5]
モルフォリノは、細菌[6]やウイルス[7]などの病原体や遺伝性疾患を標的とした医薬品治療薬として開発されています。[8]サレプタ・セラピューティクス社のモルフォリノ系薬剤エテプリルセンは、2016年9月に米国食品医薬品局からデュシェンヌ型筋ジストロフィーを引き起こすいくつかの変異の治療薬として迅速承認を受けましたが、[9]承認プロセスは論争に巻き込まれました。その他のモルフォリノ系薬剤ゴロディルセン、ビルトラルセン、カシメルセン（デュシェンヌ型筋ジストロフィー治療薬）は、2019～2021年にFDAによって承認されました。[10] [11] [12]
歴史
モルフォリノオリゴは、アンチウイルス社（現サレプタセラピューティクス）のサマートン（ジーンツールズ）によって考案され、もともとウェラーとの共同開発でした。[13]
構造
モルフォリノは、天然の核酸構造を再設計して作られた合成 分子です。[14]通常25塩基長で、標準的な核酸塩基対合によってRNAまたは一本鎖DNAの相補配列に結合します。構造上、モルフォリノとDNAの違いは、モルフォリノは標準的な核酸塩基を持ちますが、それらの塩基はリン酸ではなくホスホロジアミデート基を介して結合したメチレンモルホリン環に結合している点です。[14]図は、RNAとモルフォリノの2つの鎖の構造を比較したものです。陰イオン性リン酸を非電荷ホスホロジアミデート基に置き換えると、通常の生理学的pH範囲でのイオン化がなくなるため、生物または細胞内のモルフォリノは非電荷分子です。モルフォリノのバックボーン全体は、これらの変更されたサブユニットから作られています。
関数
モルフォリノは、多くのアンチセンス構造型（例えば、ホスホロチオエート、siRNA ）とは異なり、標的RNA分子の分解を引き起こしません。代わりに、モルフォリノは「立体ブロック」によって作用し、RNA内の標的配列に結合して、RNAと相互作用する可能性のある分子を阻害します。[15]モルフォリノオリゴは、胚における特定のmRNA転写産物の役割を調査するためによく使用されます。発生生物学者は、モルフォリノオリゴをゼブラフィッシュ[16]、アフリカツメガエル（Xenopus）[17] 、 ウニ[18]、およびメダカ（F. heteroclitus）の卵または胚に注入して形態形成胚を生成したり、モルフォリノを後期発生段階のニワトリ[19]胚に電気穿孔したりします。適切な細胞質送達システムを使用すると、モルフォリノは細胞培養で効果的です。[20] [21]オリゴが送達デンドリマーに共有結合した生体内モルフォリノは、成体動物または組織培養物に全身投与されると細胞内に入ります。[22]
真核生物における正常な遺伝子発現
真核生物では、pre-mRNAが核内で転写され、イントロンがスプライシングされてから、成熟したmRNAが核から細胞質へ輸送される。リボソームの小サブユニットは通常、mRNAの5'末端に結合することから始まり、そこで他のさまざまな真核生物の開始因子が加わり、開始複合体を形成する。開始複合体はmRNA鎖に沿って開始コドンに到達するまでスキャンし、次にリボソームの大サブユニットが小サブユニットに結合してタンパク質の翻訳が始まる。このプロセス全体を遺伝子発現と呼び、これはDNA内の塩基配列としてコード化された遺伝子の情報がタンパク質の構造に変換されるプロセスである。モルフォリノは、モルフォリノの塩基配列に応じて、スプライシングを修正したり、翻訳をブロックしたり、RNA上の他の機能部位をブロックしたりすることができる。
翻訳をブロックする
モルフォリノはメッセンジャーRNA（mRNA）の5'非翻訳領域に結合し、リボソーム開始複合体の5'キャップから開始コドンへの進行を妨害することができます。これにより、標的転写のコード領域の翻訳が防止されます（遺伝子発現の「ノックダウン」と呼ばれます）。これは、研究者が特定のタンパク質の機能を知りたい場合に実験的に役立ちます。モルフォリノは、タンパク質の発現をノックダウンし、そのノックダウンが細胞や生物にどのような変化をもたらすかを知るための便利な手段を提供します。一部のモルフォリノは、発現を非常に効果的にノックダウンするため、既存のタンパク質が分解されると、標的タンパク質はウェスタンブロットで検出できなくなります。
2016年に合成ペプチド結合PMO（PPMO）が、多くの薬剤耐性菌がカルバペネムを破壊するために使用する酵素であるニューデリーメタロβラクタマーゼの発現を阻害することが判明しました。 [23] [24]
プレmRNAスプライシングの修正
モルフォリノは、 premRNAの鎖上のイントロンの境界でスプライスを指示する小さな核内リボ核タンパク質（snRNP ）複合体が標的に結合するのを妨げることによって、または求核性の アデニン塩基をブロックしてスプライスラリアット構造の形成を妨げることによって、またはスプライスサイレンサー[25]やスプライスエンハンサー[ 26 ]などのスプライス調節タンパク質の結合を妨げることによって、premRNAの処理ステップを妨げることができる。snRNP U1（ドナー部位）またはU2 / U5（ポリピリミジン部分およびアクセプター部位）の結合を妨げると、修正スプライシングが引き起こされ、一般的には成熟mRNAからエクソンが除外される。いくつかのスプライス標的を標的とするとイントロンの包含が生じるが、隠れたスプライス部位を活性化すると部分的な包含または排除が生じる可能性がある。[27] U11 / U12 snRNPの標的もブロックすることができる。[28]スプライス修飾は逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR ）によって簡便にアッセイすることができ、RT-PCR産物のゲル電気泳動後のバンドシフトとして観察される。[2]
その他の用途: 他のmRNA部位をブロックし、プローブとして使用
モルフォリノは、 miRNAの活性[29] [30]および成熟を阻害するために使用されてきた。 [3] フルオレセインタグ付きモルフォリノをフルオレセイン特異的抗体と組み合わせると、miRNAへのin situハイブリダイゼーションのプローブとして使用できる。 [31]モルフォリノはリボザイムの活性を阻害することができる。 [32] U2およびU12 snRNPの機能は、モルフォリノによって阻害されている。[33]タンパク質コード領域内の「滑りやすい」mRNA配列を標的とするモルフォリノは、翻訳フレームシフトを誘導することができる。[34]モルフォリノは、RNA編集、[35]ポリ(A)テーリング[36]および転座配列を阻害することができる。[37]こうした多様な標的に対するモルフォリノの活性は、モルフォリノがタンパク質または核酸とmRNAの相互作用を阻害するための汎用ツールとして使用できることを示唆している。
特異性、安定性、非アンチセンス効果
モルフォリノは、成体細胞よりも遺伝子発現の範囲が広く、オフターゲット相互作用の影響を強く受ける可能性がある動物胚システムにおける標準的なノックダウンツールとなっている。単一細胞または少数細胞段階のカエルまたは魚の胚に最初に注入した後、モルフォリノの効果は、器官形成および分化のプロセスのほとんどが経過した後、標的遺伝子ノックダウンと一致する表現型が観察され、最大5日後まで測定することができる[38] 。無関係な配列を持つコントロールオリゴは通常、胚の表現型に変化をもたらさない。これは、モルフォリノオリゴの配列特異性と非アンチセンス効果の欠如の証拠である。ノックダウンに必要な用量は、同じmRNAを標的とする複数のモルフォリノオリゴを共注入することで減らすことができ、これは用量依存的なオフターゲットRNA相互作用を減らすか、または排除するための効果的な戦略である。[39]
mRNA レスキュー実験では、胚に野生型の表現型を復元し、モルフォリノの特異性の証拠を提供できる場合があります。mRNA レスキューでは、モルフォリノが、モルフォリノのタンパク質をコードする mRNA と共に注入されます。ただし、レスキュー mRNA は5'-UTR (非翻訳領域) が修正されているため、レスキュー mRNA にはモルフォリノのターゲットが含まれていません。レスキュー mRNA のコード領域は、目的のタンパク質をコードしています。レスキュー mRNA の翻訳により、モルフォリノによってノックダウンされたタンパク質の生成が置き換えられます。レスキュー mRNA は、モルフォリノのオフターゲット遺伝子発現調節による表現型の変化に影響を与えないため、この野生型の表現型への復帰は、モルフォリノの特異性のさらなる証拠となります。[38] 場合によっては、レスキュー RNA の異所性発現により、野生型の表現型の回復が不可能になります。
胚では、モルフォリノをヌル変異体でテストして予期しないRNA相互作用をチェックし、その後野生型胚で使用して急性ノックダウン表現型を明らかにすることができます。ノックダウン表現型は、変異表現型よりも極端であることが多く、変異体では、ヌル遺伝子の喪失の影響は遺伝的補償によって隠すことができます。[40]
モルフォリノは完全に不自然な骨格を持っているため、細胞タンパク質によって認識されません。ヌクレアーゼはモルフォリノを分解しません。[41]また、血清や細胞内でも分解されません。[42]
モルフォリノの最大18%は、中枢神経系およびゼブラフィッシュ胚の体節組織における細胞死を含む非標的関連の表現型を誘導すると思われる。 [43] これらの効果のほとんどはp53媒介アポトーシスの活性化によるもので、実験用モルフォリノとともに抗p53モルフォリノを同時注入することで抑制できる。さらに、モルフォリノノックダウンのp53媒介アポトーシス効果は、別のアンチセンス構造型を使用して表現型コピーされており、p53媒介アポトーシスは標的タンパク質の喪失の結果であり、ノックダウンオリゴタイプの結果ではないことが示されている。[44] これらの効果は配列特異的であると思われる。ほとんどの場合と同様に、モルフォリノが非標的効果に関連している場合、4塩基ミスマッチモルフォリノはこれらの効果を引き起こしません。
モルフォリノの使用において懸念されるのは、「オフターゲット」効果の可能性である。観察されたモルファント表現型が意図されたノックダウンによるものか、オフターゲットRNAとの相互作用によるものかは、観察されたモルファント表現型が予想されたターゲットのノックダウンの結果であることを確認する別の実験を行うことで、胚で対処できることが多い。これは、同じmRNAを標的とする重複しない2番目のモルフォリノでモルファント表現型を再現するか、[38]変異株と比較して観察された表現型を確認するか（ただし、一部の変異体では補償により表現型が不明瞭になる）、ヌル変異体バックグラウンドでモルフォリノをテストして追加の表現型の変化を検出するか、優性負性法によって行うことができる。前述のように、レスキューmRNAを共注入して観察された表現型をレスキューすることは、実行可能な場合、モルフォリノの特異性を調べる信頼できるテストである。[38] [40]
配達
モルフォリノが効果を発揮するには、細胞膜を通過して細胞の細胞質に送達されなければならない。細胞質に入ったモルフォリノは細胞質と核の間を自由に拡散し、細胞の細胞質にマイクロインジェクションした後に観察されるモルフォリノの核スプライス修飾活性によって実証されている。胚、培養細胞、成体動物への送達にはさまざまな方法が用いられる。胚への送達には通常マイクロインジェクション装置が使用され、注入は単一細胞または少数細胞の段階で最も一般的に行われる。[45]胚への送達の代替方法はエレクトロポレーションであり、これによりオリゴを後期胚段階の組織に送達することができる。[46]培養細胞への送達によく用いられる技術としては、エンドポーターペプチド（エンドソームからモルフォリノを放出させる）、[21]スペシャルデリバリーシステム（現在は市販されていないが、モルフォリノ-DNAヘテロ二本鎖とエトキシル化ポリエチレンイミン送達試薬を使用する）、[20]エレクトロポレーション、[47]またはスクレイプローディングなどがある。[48]
成体組織への送達は通常困難であるが、未修飾モルフォリノオリゴの有用な取り込みを可能にするシステムもいくつかある（デュシェンヌ型筋ジストロフィーの筋細胞への取り込み[49]やバルーン血管形成術中にストレスを受けた血管内皮細胞への取り込み[50]など）。それらは組織内の細胞間隙を効果的に浸透するが、非結合型PMOはIV投与後に健康な組織内の細胞質および核腔への分布は限られている。成体生物の多くの細胞への全身送達は、細胞浸透性ペプチドとモルフォリノオリゴの共有結合複合体を使用することで達成でき、中程度の用量のペプチド複合体で毒性が伴うが[51] [52]、観察された毒性を引き起こす用量未満の効果的なオリゴ送達のために生体内で使用されている。[7] [53]モルフォリノの末端に結合したオクタグアニジニウムデンドリマーは、修飾オリゴ（Vivo-モルフォリノと呼ばれる）を血液から細胞質に送達することができる。[22] [54] ペプチドコンジュゲートやVivo-モルフォリノなどの送達可能なモルフォリノは、ウイルス性疾患や遺伝性疾患の治療薬として有望である。[55]
参照
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さらに読む
- Wiley-Liss, Inc. 特別号: Genesis の Morpholino 遺伝子ノックダウン、第 30 巻、第 3 号、89 ～ 200 ページ (2001 年 7 月)。これはGenesisの特別号で、さまざまな動物および組織培養システムにおける遺伝子機能の Morpholino ノックダウンを使用した一連の査読済み短報論文で構成されています。
- 「ペプチド核酸、モルフォリノおよび関連するアンチセンス生体分子」Janson & During編（Springer、2007年）
- Moulton J (2007)。「モルフォリノを使用した遺伝子発現の制御 (ユニット 4.30)」。Beaucage S (編)。核酸化学の最新プロトコル。ニュージャージー州: John Wiley & Sons, Inc. ISBN 978-0-471-24662-6。