エリサ

エリサ
ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合二次抗体用のTMB基質を用いたELISAの開発
メッシュ	D004797
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酵素免疫測定法（ELISA）（/ ɪ ˈ l aɪ z ə /、/ ˌ iː ˈ l aɪ z ə /）は、 1971年にEva EngvallとPeter Perlmannによって初めて説明された、一般的に使用されている分析生化学 アッセイです。 ^{[1]このアッセイは、測定対象のリガンドに対する抗体を使用して、液体サンプル中の}リガンド（通常はタンパク質）の存在を検出する固相タイプの酵素免疫測定法（EIA）です。ELISAは、医学、植物病理学、バイオテクノロジーの診断ツールとして、またさまざまな産業における品質管理チェックとして使用されています。

ELISA の最も単純な形式では、検査するサンプルの抗原が表面に付着します。次に、抗原と結合できるように、一致する抗体が表面に塗布されます。この抗体は酵素と結合し、結合していない抗体は除去されます。最終段階で、酵素の基質を含む物質が追加されます。結合があった場合、その後の反応で検出可能な信号 (最も一般的なのは色の変化) が生成されます。

ELISA を実施するには、特定の抗原に特異性を持つ抗体が少なくとも 1 つ必要です。抗原の量が不明なサンプルは、固体支持体 (通常はポリスチレン マイクロタイター プレート) 上に、非特異的 (表面への吸着による) または特異的 (同じ抗原に特異的な別の抗体による捕捉による、「サンドイッチ」ELISA) のいずれかで固定されます。抗原が固定された後、検出抗体が追加され、抗原との複合体が形成されます。検出抗体は、酵素に共有結合するか、またはバイオコンジュゲーションによって酵素に結合した二次抗体によって検出できます。各ステップの間に、通常、プレートは中性洗剤溶液で洗浄され、非特異的に結合したタンパク質または抗体が除去されます。最後の洗浄ステップの後、プレートは酵素基質を追加して現像され、サンプル内の抗原の量を示す可視信号が生成されます。

注目すべきことに、ELISA は厳密には「免疫」アッセイではなく、他の形式のリガンド結合アッセイを実行できますが、このメソッドの一般的な使用と開発の歴史のために、名前に元々の「免疫」が付けられています。この技術には、基本的に、固相に固定できる任意のライゲーション試薬と、特異的に結合して酵素を使用して適切に定量化できる信号を生成する検出試薬が必要です。洗浄の間、リガンドとその特異的結合対応物のみが抗原抗体相互作用によって固相に特異的に結合または「免疫吸着」され、非特異的または未結合の成分は洗い流されます。同じ反応ウェル (キュベットなど) を洗浄後に再利用できる他の分光光度計ウェットラボアッセイ形式とは異なり、ELISA プレートでは、プレートの一部である固相に反応生成物が免疫吸着されるため、簡単に再利用できません。

分析生化学アッセイおよび「ウェットラボ」技術として、ELISA は、分析中も液体試薬を使用し続ける方法 (つまり、サンプル内の分析対象物質の量の測定値として簡単に定量化および解釈できる信号を生成する制御された一連の生化学反応) によって、液体サンプル内の分析対象物質 (つまり、その存在が定量的または定性的に分析される特定の物質) を検出します。この方法は、反応チャンバーまたは反応物質を封じ込めるために必要なウェル内に液体のまま留まります。^{[2] [3]}これは、乾燥ストリップを使用する「ドライラボ」技術とは対照的です。サンプルが液体 (たとえば、測定された小さな滴) であっても、「ドライ」分析の最終検出ステップでは、反射率測定法などの方法によって乾燥ストリップを読み取る必要があり、サンプル間の流出や混合を防ぐための反応封じ込めチャンバーは必要ありません。^[4]

不均一アッセイである ELISA は、物理的に固定された固相に特定の成分を吸着させることによって、分析反応混合物の成分を分離します。ELISA では、特殊な結合特性を持つ固定固相に液体サンプルが加えられ、その後、複数の液体試薬が順次加えられ、インキュベートされ、洗浄されます。その後、ウェル内の最終液体に何らかの光学的変化 (酵素反応の生成物による発色など) が起こり、そこから分析物の量が測定されます。定量的な「読み取り」は通常、分光光度計による透過光の強度の検出に基づいており、これには、液体 (およびマルチウェルプレート形式のウェルの透明な底) を通過する特定の波長の光の透過の定量が含まれます。^{[2] [3]}検出の感度は、分析反応中の信号の増幅に依存します。酵素反応はよく知られた増幅プロセスであるため、シグナルは酵素によって生成され、酵素は検出試薬と一定の割合で結合して正確な定量化を可能にするため、「酵素結合」と呼ばれます。^[5]

分析対象物は、検出試薬に特異的に結合または連結するため、リガンドとも呼ばれ、したがって、ELISAはリガンド結合アッセイのより大きなカテゴリに分類されます。^[2]リガンド特異的結合試薬は「固定化」、つまり、通常はウェルの透明な底、場合によっては側壁にコーティングされ、乾燥されます^[6] (ここでは、洗い流される固体微粒子/ビーズとは対照的に、固定された「固相」/「固体基質」)。これは通常、「ELISAプレート」と呼ばれるマルチウェルプレートとして構築されます。 従来、他の形式の免疫アッセイと同様に、抗原-抗体型反応の特異性が使用されます。これは、試薬として大量の抗原に対して特異的に抗体を生成することが容易であるためです。 あるいは、分析対象物自体が抗体である場合、その標的抗原を結合試薬として使用できます。^[7]

ELISAが開発される前は、免疫測定を行う唯一の方法は放射性標識抗原または抗体を使用する放射性免疫測定法でした。放射性免疫測定法では、放射能が信号を提供し、特定の抗原または抗体がサンプル中に存在するかどうかを示します。放射性免疫測定法は、1960年に発表されたロザリン・サスマン・ヤロウとソロモン・バーソンによる科学論文で初めて説明されました。^[8]

放射能は健康に潜在的な脅威をもたらすため、より安全な代替法が模索された。放射免疫測定法の適切な代替法は、放射性シグナルの代わりに非放射性シグナルを代用するものである。酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）が適切な基質（例えば、ABTSまたはTMB）と反応すると、色の変化が起こり、それがシグナルとして使用される。しかし、シグナルは抗体または抗原の存在と関連している必要があるため、酵素は適切な抗体に結合しなければならない。この結合プロセスは、Stratis Avrameas と GB Pierce によって独立して開発された。^[9]結合していない抗体または抗原を洗浄によって除去する必要があるため、抗体または抗原を容器の表面に固定する必要がある。つまり、免疫吸着剤を準備する必要がある。これを実現する技術は、1966 年にWide とJerker Porathによって発表された^。[10]

1971年、スウェーデンのストックホルム大学のピーター・パールマンとエヴァ・エングヴァル、およびオランダのアントン・シュースとバウケ・ファン・ウェーメンは、この知識をEIA/ELISAを実行するための方法に統合した論文を独立して発表しました。^{[11] [12]}

従来のELISAでは、通常、抗原または分析物の存在を示すために何らかの目に見える色の変化を生成する発色性レポーターと基質が使用されます。新しいELISAに似た技術では、蛍光性、電気化学発光性、定量PCRレポーターを使用して定量可能な信号を生成します。これらの新しいレポーターには、より高い感度や多重化など、さまざまな利点があります。^{[13] [14]}技術的には、このタイプの新しいアッセイは厳密にはELISAではなく、「酵素結合」ではなく、代わりに非酵素レポーターに結合しています。ただし、これらのアッセイの一般的な原理はほぼ同じであるため、ELISAと同じカテゴリに分類されることがよくあります。

2012年、ナノ粒子を色素生成レポーターとして用いた超高感度の酵素ベースのELISA検査により、わずかアトグラムの分析対象物を検出するだけで、肉眼で色信号を出すことができるようになった。陽性の結果は青色、陰性の結果は赤色で表示される。この検出では分析対象物の有無のみを確認でき、実際の濃度は確認できないことに注意すること。^[15]

特定の分子に対して、対応する抗体を使用するELISA検査は数多くあります。ELISA検査は、分析対象物と抗体がどのように結合して使用されるかに基づいて、いくつかの種類の検査に分類されます。^{[16] [17]}ここでは主な種類について説明します。^[18]

^{直接ELISA法[19]}の手順は以下の通りである。

• 検査対象となる抗原の緩衝溶液をマイクロタイタープレートの各ウェル（通常は 96 ウェル プレート）に加え、電荷相互作用によって抗原がプラスチックに付着する時間を待ちます。
• 抗原で覆われていないウェル内のプラスチック表面を覆うために、ウシ血清アルブミンやカゼインなどの非反応性タンパク質の溶液を各ウェルに加えます。
• 結合した（結合した）酵素を備えた一次抗体が追加され、ウェルをコーティングした試験抗原に特異的に結合します。
• 次に、この酵素の基質を加えます。多くの場合、この基質は酵素と反応して色が変わります。
• 血清中に存在する一次抗体の濃度が高いほど、色の変化は強くなります。多くの場合、色の強さの定量的な値を得るために分光計が使用されます。

酵素は増幅剤として作用します。酵素結合抗体がほんのわずかしか結合していなくても、酵素分子は多くのシグナル分子を生成します。常識的な制限内では、酵素は色を無期限に生成し続けることができますが、結合する抗体が多いほど、色はより速く現れます。直接 ELISA の主な欠点は、抗原固定化の方法が特異的ではないことです。血清をテスト抗原のソースとして使用すると、サンプル内のすべてのタンパク質がマイクロタイタープレートのウェルに付着する可能性があるため、血清中の低濃度の分析対象物は、ウェルの表面に結合する際に他の血清タンパク質と競合する必要があります。サンドイッチまたは間接 ELISA は、テスト抗原に特異的な「捕捉」抗体を使用して血清の分子混合物から抗原を引き出すことで、この問題の解決策を提供します。^{[引用が必要]}

ELISA は定性または定量形式で実行できます。定性結果は、サンプルに対して単純に陽性または陰性 (はいまたはいいえ) の結果を提供します。陽性と陰性のカットオフは分析者によって決定され、統計的である場合があります。陽性サンプルと陰性サンプルを区別するために、標準偏差 (テストに固有のエラー) の 2 倍または 3 倍がよく使用されます。定量 ELISA では、サンプルの光学密度 (OD) が標準曲線と比較されます。標準曲線は通常、ターゲット分子の既知濃度溶液の連続希釈です。たとえば、テストサンプルの OD が 1.0 の場合、OD = 1.0 を与える標準曲線上の点は、サンプルと同じ分析対象濃度である必要があります。^{[引用が必要]}

「間接 ELISA」と「直接 ELISA」という名称の使用法と意味は、実験のコンテキストに応じて文献や Web サイトによって異なります。抗原の存在を分析する場合、「直接 ELISA」という名称は、標識された一次抗体のみが使用される ELISA を指し、「間接 ELISA」という用語は、抗原が一次抗体に結合し、標識された二次抗体によって検出される ELISA を指します。後者の場合、サンドイッチ ELISA は間接 ELISA とは明確に区別されます。「一次」抗体が対象である場合 (たとえば、免疫分析の場合)、この抗体は二次抗体によって直接検出され、「間接 ELISA」という用語は 2 つの抗体を使用する設定に適用されます。^{[引用が必要]}

サンプル抗原の検出には「サンドイッチ」ELISA法が用いられる。^[20]手順は以下の通り。

1. 既知量の捕捉抗体を用いて表面を準備します。
2. 表面上の非特異的結合部位はすべてブロックされます。
3. 抗原を含むサンプルをプレートに塗布し、抗体によって捕捉します。
4. プレートを洗浄して、結合していない抗原を除去します。
5. 特定の抗体が追加され、抗原に結合します (「サンドイッチ」と呼ばれるのは、抗原が 2 つの抗体の間に挟まっているためです)。この一次抗体は、抗原に対する反応性を検査するために、ドナーの血清中に存在することができます。
6. 酵素結合二次抗体は検出抗体として適用され、抗体の Fc 領域に特異的に結合します (非特異的)。
7. プレートを洗浄して、結合していない抗体-酵素複合体を除去します。
8. 化学物質が追加され、酵素によって色、蛍光、または電気化学信号に変換されます。
9. プレートのウェルの吸光度、蛍光、または電気化学信号（例：電流）を測定して、抗原の存在と量を判定します。

右の画像には酵素に結合した二次抗体が使用されていますが、技術的には、一次抗体が酵素に結合している場合はこれは必要ありません (直接 ELISA になります)。ただし、二次抗体結合体を使用すると、検出したいすべての抗原に対して酵素結合抗体を作成するという高価なプロセスが回避されます。他の抗体の Fc 領域に結合する酵素結合抗体を使用することで、この同じ酵素結合抗体をさまざまな状況で使用できます。最初の層の「捕捉」抗体がなければ、サンプル内のタンパク質 (血清タンパク質を含む) がプレート表面に競合的に吸着し、固定化された抗原の量が少なくなる可能性があります。精製された特定の抗体を使用して抗原をプラスチックに付着させると、測定前に複雑な混合物から抗原を精製する必要がなくなり、アッセイが簡素化され、アッセイの特異性と感度が向上します。したがって、研究に使用されるサンドイッチ ELISA では、偽陽性結果のリスクを減らすために検証が必要になることがよくあります。^[21]

ELISA の 3 番目の用途は競合結合です。この ELISA の手順は、最初の 2 つの例とは多少異なります。

標識されていない抗体をその抗原（サンプル）の存在下でインキュベートします。

1. 次に、結合した抗体/抗原複合体を抗原でコーティングしたウェルに追加します。
2. プレートを洗浄すると、結合していない抗体が除去されます。(サンプル内の抗原が多いほど、形成される Ag-Ab 複合体が多くなり、ウェル内の抗原に結合できる結合していない抗体が少なくなり、「競合」が発生します。)
3. 一次抗体に特異的な二次抗体が追加されます。この二次抗体は酵素と結合します。
4. 基質が追加され、残りの酵素が発色信号または蛍光信号を誘発します。
5. 信号が最終的に飽和するのを防ぐために、反応は停止されます。

一部の競合 ELISA キットには、酵素結合抗体ではなく酵素結合抗原が含まれています。標識抗原は、サンプル抗原 (標識なし) と一次抗体結合部位を競合します。サンプル内の抗原が少ないほど、ウェル内に保持される標識抗原が多くなり、信号が強くなります。

通常、抗原は最初にウェル内に配置されるわけではありません。

HIV 抗体の検出では、マイクロタイタープレートのウェルに HIV 抗原を塗布します。2 つの特異的抗体が使用されます。1 つは酵素と結合したもので、もう 1 つは血清中に存在する抗体です (血清が抗体陽性の場合)。同じ抗原に対して 2 つの抗体間で累積的な競合が発生し、より強い信号が見られるようになります。検査する血清をこれらのウェルに加え、37 °C でインキュベートしてから洗浄します。抗体が存在する場合、抗原抗体反応が発生します。酵素標識された特異的 HIV 抗体に対しては抗原は残りません。これらの抗体は添加後も遊離したままで、洗浄中に洗い流されます。基質は添加されますが、それに作用する酵素がないため、陽性の結果では色の変化は見られません。

4番目のELISA検査では、従来のウェルは使用せず、抗原を検査液中に懸濁させたままにします。^{[22] [23]}

1. 標識されていない抗体を抗原（サンプル）の存在下でインキュベートする
2. 抗体が抗原に結合できるように十分なインキュベーション期間が設けられます。
3. 次に、サンプルはスカベンジャー コンテナを通過します。スカベンジャー コンテナは、試験管または特別に設計されたフロー スルー チャネルです。スカベンジャー コンテナまたはチャネルの表面には、「スカベンジャー抗原」が結合しています。これらは、遊離抗体が結合する主要な抗原と同一であるか、十分に類似している場合があります。
4. スカベンジャー容器には、スカベンジャー抗原がサンプルに導入された余分な抗体すべてに結合できるように十分な表面積と十分な時間が必要です。
5. 標識抗体が結合したサンプルは検出器に通される。この装置はフローサイトメーターやタグを照射して反応を記録する他の装置でもよい。^[24]

この検査では、複数の抗原を同時にタグ付けしてカウントできます。これにより、特定の細菌株を 2 つ (またはそれ以上) の異なる色のタグで識別できます。細胞に両方のタグが存在する場合、その細胞はその特定の株です。一方しか存在しない場合は、そうではありません。

このテストは、通常、一度に 1 つのテストを実行するため、マイクロタイタープレートでは実行できません。必要な機器は通常それほど複雑ではなく、現場で使用できます。

次の表は、ELISA アッセイで一般的に使用される酵素マーカーを示しています。これにより、アッセイの完了時に結果を測定できます。

• OPD（o-フェニレンジアミン二塩酸塩）は琥珀色に変わり、共役タンパク質としてよく使用されるHRP（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）を検出します。^[25]
• TMB（3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン）はHRPを検出すると青色に変わり、硫酸ま​​たはリン酸を添加すると黄色に変わります。^[25]
• ABTS（2,2'-アジノビス[3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸]-ジアンモニウム塩）はHRPを検出すると緑色に変わります。^[25]
• PNPP（p-ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩）はアルカリホスファターゼを検出すると黄色に変わります。^[25]

ELISAはサンプル中の抗原または抗体の存在を評価するために実施できるため、血清中の抗体濃度を決定するための有用なツールです（ HIV検査^[26]やウエストナイルウイルスなど）。また、食品業界では、牛乳、ピーナッツ、クルミ、アーモンド、卵などの潜在的な食物アレルゲンの検出^[27]や、セリアック病の血清学的血液検査としても応用されています。^{[28] [29]} ELISAは、特定の薬物クラスの迅速な推定スクリーニングとして毒物学でも使用できます。

ELISA は、その高い感度から、HIV 検査に広く使用された最初のスクリーニング検査です。ELISA では、人の血清を 400 倍に希釈し、HIV 抗原が付着したプレートに塗布します。血清に HIV に対する抗体が存在する場合、抗体はこれらの HIV 抗原に結合する可能性があります。次にプレートを洗浄して、血清の他の成分をすべて除去します。次に、特別に調製された「二次抗体」(他の抗体に結合する抗体) をプレートに塗布し、もう一度洗浄します。この二次抗体は、事前に酵素に化学的に結合しています。

したがって、プレートには、プレートに結合した二次抗体の量に比例した酵素が含まれます。酵素の基質が適用され、酵素による触媒作用によって色または蛍光が変化します。ELISA の結果は数値で報告されます。このテストで最も議論を呼ぶのは、陽性結果と陰性結果の間の「カットオフ」ポイントを決定することです。

カットオフ ポイントは、既知の標準と比較することによって決定できます。職場での薬物スクリーニングに ELISA テストを使用する場合、カットオフ濃度 (たとえば 50 ng/ml) が設定され、標準濃度の分析対象物を含むサンプルが準備されます。既知のサンプルよりも強い信号を生成する未知の物質は「陽性」です。より弱い信号を生成する未知の物質は「陰性」です。

デング熱、マラリア、シャーガス病、^[30] ヨーネ病など、さまざまな種類の病気を検出するためのELISA検査があります。 ^{[31] ELISA検査は、}医療研究室での体外診断にも広く使用されています。 ELISAの他の用途は次のとおりです。

• 血液サンプル中のSARS-CoV-2抗体の検出^[32]

ELISAは2023年現在、世界中で植物病原体検出の主な方法となっている。^[33]

eSimoa（酵素結合単一分子アレイ）は、臨床診断や研究で広く利用されている従来のELISA（酵素結合免疫吸着測定法）技術の大きな進化を表しています。eSimoaは、生体分子検出の感度と解像度を大幅に向上させることで、ELISAの機能を拡張し、これまで標準的なアッセイでは達成できなかった濃度の生体分子の検出を可能にします。^[34]

eSimoa は ELISA の基本原理に基づいて、常磁性ビーズを使用して、ELISA のプレートベースの検出に似た方法で生体分子または酵素を分離します。ただし、eSimoa は単一分子レベルでの酵素反応測定を可能にすることでこの概念を進化させ、さまざまな酵素と生体分子の検出限界を大幅に向上させます。この方法により、従来の ELISA の検出閾値を下回ることが多い、低存在量のタンパク質や、タンパク質キナーゼやテロメラーゼなどの重要な酵素の活性を正確に定量化できます。

eSimoa の感度の向上は、臨床診断におけるバイオマーカーの早期かつ正確な検出に不可欠であり、病気の監視と管理の向上に役立ちます。創薬においては、酵素活性の微妙な変化を追跡する能力が、酵素阻害メカニズムに関する詳細な洞察を提供することで、より効果的な医薬品の開発に役立ちます。

国立台湾大学（NTU）のチェン・チアンは、彼女のチームがこの革新的な技術を開発したと主張している。^{[35] [36]}しかし、この主張は、ハーバード大学のデイビッド・R・ウォルトのチームによる以前の出版物の存在によって異議を唱えられており、彼らは2020年にeSimoaに関する研究を発表している。^{[34] [37]}ウォルトのチームによるこの以前の文書は、この技術の開発への以前の貢献を示唆している。

• 凝集PCR
• 免疫スクリーニング
• ラテラルフローテスト
• 磁気免疫測定
• マイクロタイタープレート
• 比濁法
• プラーク減少中和試験
• プレートリーダー
• 分泌アッセイ

• 米国国立医学図書館医学件名標目表(MeSH)の ELISA
• 「ELISA 活動の紹介」—アリゾナ大学でのアニメーションを含む、HIV 検出に使用される ELISA の初心者向けウォークスルー
• 「ELISA アッセイの原理」 - Assay Genie での ELISA の原理と分析結果の検出ツールの概要