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リガンド結合アッセイ（LBA）は、リガンド分子が受容体、抗体、またはその他の高分子に結合することを利用したアッセイまたは分析手順です。[1]形成されたリガンド受容体複合体の存在と量を決定するために検出方法が使用され、これは通常、電気化学的に、または蛍光検出法によって決定されます。[2]このタイプの分析テストは、受容体に結合することが知られているサンプル内の標的分子の存在をテストするために使用できます。[3]
リガンド結合アッセイには、放射性および非放射性の両方を含む多数の種類があります。 [4] [5] [6]いくつかの新しいタイプは、結合していない試薬の除去を省くなど、完了に必要な手順が少ないため、「混合して測定する」アッセイと呼ばれています。[5]
リガンド結合アッセイは、主に薬理学の分野でさまざまな用途に使用されています。具体的には、人体には内因性の 受容体、ホルモン、その他の神経伝達物質がありますが、薬理学者は内因性の細胞成分を選択的に、または模倣した薬剤を作成するためにアッセイを利用しています。一方、このような技術は、さらなるカスケードを防ぐために受容体拮抗薬を作成するためにも利用できます。[7]このような進歩により、研究者はホルモンやホルモン受容体を定量化できるだけでなく、薬剤開発や治療計画に重要な薬理学的情報を提供することもできます。[8]
歴史
歴史的に、リガンド結合アッセイ技術は、血漿または組織中のホルモンまたはホルモン受容体の濃度を定量化するために広く使用されていました。リガンド結合アッセイ法は、試験サンプルの効果をさまざまな量の既知のタンパク質 (リガンド)の結果と比較することにより、試験物質中のホルモンの濃度を定量化します。
リガンド結合アッセイの基礎は、 1945年のカール・ランドシュタイナーと、特定のタンパク質に対する抗体の産生による動物の免疫化に関する研究によって築かれました。[9]ランドシュタイナーの研究は、免疫アッセイ技術によって研究者が分子レベルで分析できることを実証しました。最初の成功したリガンド結合アッセイは、1960年にロザリン・サスマン・ヤローとソロモン・バーソンによって報告されました。[9]彼らは、インスリンとインスリン特異的抗体の結合相互作用を調査し、さらにインスリンの最初の放射免疫アッセイ(RIA) を開発しました。これらの発見は、血液ベースの体液内に含まれるタンパク質ホルモンの感度と特異性の両方に関する貴重な情報を提供しました。[9]ヤローとバーソンは、その進歩によりノーベル医学賞を受賞しました。RIA技術の開発により、研究者は放射能の使用を超えて、代わりに液相と固相、競合、免疫放射測定アッセイを使用できるようになっています。[9]これらの画期的な発見の直接的な結果として、研究者は生物学、化学などの分野の多くの側面でリガンド結合アッセイの進歩を続けてきました。たとえば、カリフォルニア工科大学のロイス研究室は、脳内の情報の流れを追跡するために、ニューロン上に人工リガンドと受容体を設計して使用しています。[10]彼らは特に、リガンド誘導性膜内タンパク質分解を使用して、ショウジョウバエやその他のモデルの脳の配線を解明しています。[11]あるニューロン上の人工リガンドが別のニューロン上の受容体に結合すると、受容体ニューロンでGFP発現が活性化され、神経科学と生物学におけるリガンド結合アッセイの有用性が実証されています。[12]
アプリケーション
リガンド結合アッセイは、タンパク質結合などの2つの分子間で起こる相互作用、および反応物が結合する親和性の程度（弱い、強い、または結合なし）の尺度を提供します。 [13]結合アッセイの重要な側面には、反応物または生成物の濃度レベル（放射性セクションを参照）、アッセイ全体にわたる反応物の平衡定数の維持、および関連する反応の信頼性と妥当性が含まれますが、これらに限定されません。[13]結合アッセイは単純ですが、テスト対象の化合物がターゲットの機能に影響を与えるかどうかに関する情報は提供されません。[14]
放射性リガンドアッセイ
放射性リガンドは受容体へのリガンドの結合を測定するために使用され、理想的には高い親和性、低い非特異的結合、低い受容体密度を検出するための高い特異的活性、および受容体特異性を備えている必要があります。[7]
放射性リガンドの放射能レベル（モルあたり）は比活性（SA）と呼ばれ、Ci/mmolで測定されます。[15]放射性リガンドの実際の濃度は、放射性リガンドが由来する特定のストックミックス（製造元から）によって決まります。[15]実際の濃度は次の式で決まります。
[15]
飽和結合
飽和分析は、組織ホモゲネートから部分的に精製された血漿の分画、クローン化された受容体を導入した細胞、培養中または分析前に分離された細胞など、さまざまな種類の組織で使用されます。[7]飽和結合分析では、受容体の親和性と密度を測定できます。新しいリガンドに対して選択した濃度は、経験的に決定する必要があります。
この種の実験では、一般的に2つの戦略が採用されています。[7]一定の比活性と放射性リガンドの濃度を維持しながら、添加する放射性リガンドの量を増やすか、または非標識リガンドの添加により放射性リガンドの比活性を低下させるかです。[7]
スキャッチャードプロット
スキャッチャード プロット(ローゼンタール プロット) は、放射性リガンドの親和性を示すために使用できます。このタイプのプロットでは、結合/遊離放射性リガンドの比率が結合放射性リガンドに対してプロットされます。線の傾きは、親和性定数(K)の逆数の負に等しくなります。線と X 軸の切片は、Bmax の推定値です。[7]スキャッチャード プロットは、適切な基準に対して標準化できるため、さまざまな研究や組織で受容体密度を直接比較できます。[7]このサンプル プロットは、放射性リガンドが単一の親和性で結合することを示しています。リガンドが異なる放射性リガンド親和性を持つ複数の部位に結合した場合、スキャッチャード プロットは代わりに凹状の線を示します。[7]
非線形曲線フィッティング
平衡結合データ分析（EBDA）やLIGANDなどの非線形曲線フィッティングプログラムは、飽和および競合結合実験から結合パラメータの推定値を計算するために使用されます。[16] EBDAは、測定された放射能をモル濃度に変換し、データからヒル勾配とスキャッチャード変換を作成する初期分析を実行します。EBDAによる分析は、LIGANDによって結合の特定のモデルを推定するために使用できます。[16]
競争の拘束力
競合結合は、受容体サブタイプに対する特定のリガンドの選択性の有無を判断するために使用され、これにより組織内の各サブタイプの密度と割合を判断できます。[7 ]競合曲線は、競合リガンドの対数濃度に対して、全結合のパーセンテージである特異的結合をプロットすることによって得られます。[7]急勾配の競合曲線は通常、単一の受容体集団への結合を示しますが、緩やかな曲線、または明確な変曲点のある曲線は、複数の結合部位集団への結合を示します。[16]
非放射性結合アッセイ
非放射性アッセイにはさまざまな技術が使用されていますが、リガンドは放射性同等物と同様の結合特性を示す必要があります。したがって、非放射性アッセイと放射性アッセイの両方の結果は一貫しています。[5] 放射性リガンドアッセイと非放射性リガンドアッセイの最大の違いの1つは、人体への危険性に関するものです。放射性アッセイは放射性廃棄物を生成するという点で有害ですが、非放射性リガンドアッセイでは、有毒廃棄物の生成を避けるために別の方法を使用します。これらの方法には、蛍光偏光（FP）、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）、表面プラズモン共鳴（SPR）が含まれますが、これらに限定されません。リガンド受容体結合のプロセスを測定するために、ほとんどの非放射性方法では、分子相互作用を妨げないようにラベル付けする必要があります。[5]
蛍光偏光
蛍光偏光（FP）は蛍光異方性と同義です。この方法は、蛍光標識リガンドが受容体に結合した後の回転速度の変化を測定します。[5] 偏光はリガンドを励起するために使用され、放出される光の量を測定します。[5]放出される光の 脱分極は、結合しているリガンド（例えば、受容体）に依存します。リガンドが結合していない場合、脱分極は大きくなります（リガンドは自由に高速回転し、光を回転させます）。リガンドが結合している場合は、サイズが大きくなるため回転が遅くなり、脱分極が減少します。[5]この方法の利点は、標識付けのステップが 1 つだけ必要なことです。ただし、この方法は低ナノモル濃度 では精度が低くなります。 [5]
運動排除アッセイ
キネティック排除アッセイ（KinExA）は、リガンド、受容体、リガンド受容体複合体の混合物中に存在する遊離（未結合）リガンドまたは遊離受容体を測定する。この測定により、活性リガンド濃度と相互作用の結合定数（平衡、オンおよびオフ速度）を定量化することができる。[17]
蛍光共鳴エネルギー移動
蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）は、近接するドナー分子とアクセプター分子の間で移動するエネルギーを利用します。[5] FRETは、FPと同様に蛍光標識リガンドを使用します。[5] FRET内のエネルギー移動は、ドナーを励起することから始まります。[5]ドナーとアクセプター分子間の双極子間相互作用により、 エネルギーがドナーからアクセプター分子に移動します。 [5] リガンドが受容体抗体複合体に結合すると、アクセプターが光を発します。[5] FRETを使用する場合、アクセプターとドナー間の距離が10 nm未満であること、アクセプターとドナー間の吸収スペクトル が重なり合っていること、および抗体がリガンド結合部位を妨害またはブロックしないことが重要です。[5]
表面プラズモン共鳴
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表面プラズモン共鳴（SPR）では、リガンドの標識は不要です。[5] 代わりに、表面から反射される偏光の角度（屈折率）の変化を測定することで機能します。[5] この角度は、質量または層の厚さの変化に関連しており、例えばリガンドの固定化により共鳴角度が変わり、反射光が増加します。[5] SPRが派生したデバイスには、センサーチップ、フローセル、光源、プリズム、および固定角度位置検出器が含まれます。[5]
液相結合アッセイ
免疫沈降法
免疫沈降法（IP）の液相リガンド結合アッセイは、複雑な混合物から抗体を使用して特定のタンパク質またはタンパク質群を精製または濃縮するために使用される方法です。破壊された組織または細胞の抽出物を目的の抗原に対する抗体と混合すると、抗原抗体複合体が生成されます。[18]抗原濃度が低い場合、抗原抗体複合体の沈殿には数時間から数日かかることがあり、形成された少量の沈殿物を分離することが困難になります。[18]
酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）またはウェスタンブロッティングは、精製された抗原（または複数の抗原）を取得して分析するための2つの異なる方法です。この方法では、アガロース樹脂などの固体（ビーズ状）支持体に付着した抗体の助けを借りて抗原を精製します。[19]固定化されたタンパク質複合体は、1つのステップまたは連続的に達成できます。[19]
IPは生合成放射性同位元素標識と組み合わせて使用することもできます。この技術の組み合わせを使用すると、特定の抗原が組織によって合成されたのか、細胞によって合成されたのかを判断できます。[18]
固相結合アッセイ
マルチウェルプレート
マルチウェルプレートは、1つの容器に複数のペトリ皿が組み込まれており、個々のウェルの数は6から1536以上まであります。マルチウェルプレートアッセイは、必要な投与量と反復を処理するのに便利です。[20]標準化されたフットプリント、サポート機器、および測定システムを備えたさまざまなプレートタイプがあります。[20] 結合アッセイの結果として情報を取得するために、電極をプレートの底に組み込むことができます。 [9]結合試薬は電極表面に固定化され、分析できます。[9]
マルチウェルプレートは、研究者が各マルチウェルプレート内で異なるタイプのアッセイ（すなわち、バイオアッセイ、免疫アッセイなど）を作成および操作できるように製造されています。 [20]マルチウェルプレートのフォーマットのばらつきにより、アーティファクトが発生することは珍しくありません。アーティファクトは、プレート上の異なるウェル内、特にウェルの端と中央付近に見られる異なる環境によるものです。このような影響は、ウェル効果、エッジ効果、プレート効果として知られています。したがって、各プレート内および各プレート間でアッセイデザインを正しい方法で配置する必要性を強調しています。[20]
マルチウェルプレートは、in vitro生物学的アッセイ活性を測定する場合や、免疫アッセイによる免疫反応性を測定する場合によく使用されます。 [ 20 ] 湿度を下げるために大気圧と温度率を維持することに加えて、各ウェルに特定の培地を同じ量適用してプレートの均一性を維持することで、アーティファクトを回避できます。[20]
ビーズバインディング
ビーズ上のリガンド結合アッセイは、定義されていない懸濁液中に存在する塩基性タンパク質、DNA/RNA、またはその他の生体分子の分離方法であり、複数のバイオクロマトグラフィーアプリケーションで使用できます。バイオアフィンリガンドは、末端に負に帯電したシラノール基を持つシリカビーズまたはポリスチレンビーズに共有結合しており、塩基性タンパク質の分離と精製、または生体分子の吸着に使用されます。結合後、分離は遠心分離（密度分離）または磁場吸引（磁性粒子のみ）によって行われます。ビーズは、イオン交換法で溶解する前に洗浄して、分離された分子の純度を高めることができます。酵素/蛍光検出（HRP、蛍光色素など）に基づく直接分析方法は、結合した生体分子のビーズ上での測定または定量に使用できます。 [21] [22] [23]
オンカラムバインディング
フィルター
フィルターアッセイは、フィルターを使用して 2 つの分子間の親和性を測定する固相リガンド結合アッセイです。フィルター結合アッセイでは、フィルターを使用して培地を吸い込み、細胞膜を捕捉します。[8] この迅速な方法は、高速で行われるため、見つかった画分の濾過と回収が可能です。[24]バッファーでフィルターを洗浄すると、結合していない残留リガンドと、結合部位から洗い流される可能性のあるその他のリガンドが除去されます。[8]フィルターの洗浄中に存在する受容体-リガンド複合体は、フィルターによって完全に捕捉されるため、大きく解離することはありません。[8]フィルターの特性は、実行される各ジョブにとって重要です。より厚いフィルターは、小さな膜片をより完全に回収するのに役立ちますが、より長い洗浄時間が必要になる場合があります。[8]負に帯電した膜片を捕捉するために、フィルターを前処理することをお勧めします。[8]フィルターに正の表面電荷を与える溶液にフィルターを浸すと、負に帯電した膜断片が引き寄せられます。[8]
リアルタイム細胞結合
このタイプのアッセイでは、リガンドの細胞への結合を経時的に追跡します。得られた信号は、細胞表面上の標的構造（多くの場合、受容体）に結合したリガンドの数に比例します。リガンド-標的相互作用に関する情報は、時間の経過に伴う信号の変化から得られ、結合速度定数k a、解離速度定数k d、親和性K Dなどの速度論パラメータを計算できます。[25]細胞上で直接相互作用を測定することにより、標的タンパク質の単離は不要です。そうでなければ、特に一部の膜タンパク質では困難になる可能性があります。[26]意図した標的構造との相互作用が確実に測定されるように、標的構造を発現していない細胞などの適切な生物学的コントロールが推奨されます。
ラベルフリーまたはラベルベースのアプローチを使用したリアルタイム測定は、固定細胞または生細胞上の生体分子相互作用を分析するために使用されてきました。[27] [28]
リガンド-受容体相互作用をリアルタイムで測定する利点は、親和性を正確に測定するために結合平衡に達する必要がないことである。[29]
結合特異性
薬物の効果は、生物の高分子特性との結合選択性、またはさまざまなリガンドが基質に結合する親和性の結果です。 [30]より具体的には、リガンドのそれぞれの受容体に対する特異性と選択性により、研究者はリガンドの濃度と受容体の密度を操作することで、特定の薬物効果を分離して生成することができます。[30]ホルモンと神経伝達物質は、生物内の生理学的受容体に影響を及ぼす重要な内因性調節リガンドです。[30]これらの受容体に作用する薬物は、シグナル分子から必要な反応を生成するために非常に選択的です。[30]
特異的結合とは、リガンドが受容体に結合することを指し、1つのリガンドに対して複数の特異的結合部位が存在する可能性がある。[31]非特異的結合とは、リガンドが、さまざまな他の受容体や細胞膜内のさまざまな種類のトランスポーターなど、指定された受容体以外のものに結合することである。[31]たとえば、さまざまな拮抗薬が複数の種類の受容体に結合する可能性がある。ムスカリン拮抗薬の場合、ヒスタミン受容体にも結合する可能性がある。[31]このような結合パターンは、リガンドの宛先が複数の受容体に特異的であるため、技術的には特異的であると見なされる。ただし、研究者は、他の結合因子と比較して、このような動作に焦点を当てていない可能性がある。[31]それにもかかわらず、非特異的結合動作は取得すべき非常に重要な情報である。これらの推定値は、リガンドが受容体に結合すると同時に、特異的結合の発生を妨げる代替剤（拮抗薬）に反応する方法を調べることによって測定される。[31]
リガンドと受容体の相互作用に対する特定の結合タイプ：[30]
技術の進歩
リガンド結合アッセイの技術は、精度と感度を維持しながら、速度を上げ、費用対効果の高い手順を維持することに関連して進歩し続けています。[9] 技術的な進歩には、抗体の代替としての新しい結合試薬、[9]代替の染料溶液とマイクロプレートシステム、および多くのリガンド結合アッセイプロセスで必要とされる濾過ステップを省略する方法の開発が含まれます。[16]
細胞内の主要なシグナル分子はカルシウム（Ca 2+ ）であり、これはFluo-4アセトキシメチル色素で検出できます。これは遊離Ca 2+イオンに結合し、Fluo-4 AMの蛍光をわずかに増加させます。[16] Fluo-4色素製剤の欠点は、不要なバックグラウンドシグナルを提供する可能性のある細胞外色素を除去するために洗浄ステップが必要なことです。たとえば、洗浄は細胞に余分なストレスを与えるだけでなく、時間を消費するため、タイムリーな分析が妨げられます。[16] 最近、洗浄ステップを必要としないカルシウム3アッセイ試薬を使用するFLIPR®（蛍光イメージングプレートリーダー）と呼ばれる代替の色素溶液とマイクロプレートシステムが開発されました。その結果、励起レーザーと電荷結合素子を使用して、色素の蛍光の変化を遅延なくリアルタイムで観察できます。[16]
多くのリガンド結合アッセイでは、スクリーニングの前に結合リガンドと非結合リガンドを分離する濾過ステップが必要です。シンチレーション近接アッセイ(SPA) と呼ばれる方法が最近開発され、この重要なステップが不要になりました。この方法は、リガンド結合分子でコーティングされ、セリウムイオンで満たされた結晶格子ビーズを介して機能します。これらのビーズは、同位体によって刺激されると光のバーストを発し、簡単に測定できます。リガンドは 3H または 125I を使用して放射標識され、アッセイに放出されます。ビーズに直接結合した放射性リガンドのみが信号を開始するため、フリーリガンドはスクリーニングプロセス中に干渉しません。[16]
制限事項
本来、アッセイは試験管内で制御された環境で実施する必要があるため、この方法では生体内での受容体結合に関する情報は得られません。得られた結果では、特定のリガンドが受容体に適合することしか確認できませんが、アッセイでは生物内のリガンド結合受容体の分布を知ることはできません。
体内のリガンド結合と受容体の分布は、陽電子放出断層撮影（PET）を使用して研究することができます。これは、放射性核種をリガンドに誘導し、研究対象の生物の体内に放出することによって機能します。放射性標識されたリガンドは、PETスキャナーによって空間的に位置付けられ、生物内の受容体の濃度が高い領域を明らかにします。[16]
参照
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