比較ゲノムハイブリダイゼーション

比較ゲノムハイブリダイゼーション（CGH）は、細胞を培養することなく、試験サンプルと参照サンプルのDNAの倍数性レベルに対するコピー数変異（CNV）を分析する分子細胞遺伝学的手法である。この手法の目的は、2つのソース（ほとんどの場合は密接に関連している）から生じた2つのゲノムDNAサンプルを迅速かつ効率的に比較することである。これは、全染色体または染色体下領域（全染色体の一部）の増加または減少に関して差異が含まれていると疑われるためである。この手法は、もともと固形腫瘍と正常組織の染色体相補体間の差異を評価するために開発されたものであり、^{[1]使用する顕微鏡の解像度によって制限される}ギムザバンド法や蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）などの従来の細胞遺伝学的分析手法と比較して、 5～10メガベースという改善された解像度を備えている。^{[2] [3]}

これは、競合的蛍光 in situ ハイブリダイゼーションを使用することで実現されます。簡単に言うと、比較する 2 つのソース (最も一般的にはテスト ソースと参照ソース) から DNA を分離し、各DNAサンプルを異なる色 (通常は赤と緑) の蛍光体(蛍光分子) で個別にラベル付けし、 DNA を変性させて一本鎖にし、結果として得られた 2 つのサンプルを 1:1 の比率で染色体の通常の中期スプレッドにハイブリダイズさせます。ラベル付けされた DNA サンプルは、その起源の場所でこれに結合します。蛍光顕微鏡とコンピューター ソフトウェアを使用して、異なる色の蛍光信号を各染色体の長さに沿って比較し、2 つのソース間の染色体の違いを識別します。染色体の特定の領域でテスト サンプルの色の強度が高いことは、対応するソース サンプルでその領域の物質が増加したことを示し、参照サンプルの色の強度が高いことは、テスト サンプルのその特定の領域の物質が減少したことを示します。中性色（蛍光標識が赤と緑の場合は黄色）は、その場所の2つのサンプル間に違いがないことを示します。^{[2] [3]}

CGHは不均衡な染色体異常しか検出できません。これは、相互転座、逆位、環状染色体などの均衡した染色体異常はコピー数に影響を与えないためであり、CGH技術によって検出されます。ただし、CGHでは、1回の検査で46本のヒト染色体すべてを調査でき、顕微鏡的スケールでも欠失や重複を発見できるため、他の細胞学的技術でさらに調査する候補遺伝子の特定につながる可能性があります。^[2]

DNAマイクロアレイをCGH技術と組み合わせて使用​​することで、より特異的なアレイCGH（aCGH）が開発され、100キロベースという高解像度でCNVを遺伝子座ごとに測定できるようになりました。^{[4] [5]}この改良された技術により、既知および未知の病因を発見することができます。

CGH開発の動機は、当時利用可能な細胞遺伝学的分析法（ギムザ染色法とFISH）では、結果の解釈に必要な顕微鏡によって解像度が制限されていたという事実に由来しています。さらに、ギムザ染色法の 解釈は曖昧になる可能性があり、信頼性が低下し、どちらの技術も多大な労力を必要とするため、検査できる部位が制限されます。 ^[4]

CGH 分析の最初の報告は、1992 年にカリフォルニア大学サンフランシスコ校の Kallioniemi と同僚によってなされました。彼らは固形腫瘍の分析に CGH を使用しました。彼らは、乳がん細胞株と原発性膀胱腫瘍の両方にこの技術を直接適用し、細胞の完全なコピー数核型を確立することでこれを達成しました。彼らは 16 の異なる増幅領域を特定することができ、その多くは新しい発見でした。^[1]

その後すぐに、1993 年にデュ マノワールらは、実質的に同じ手法を報告しました。著者らは、DNA ライブラリから一連の個々のヒト染色体を2 つの異なる蛍光体で異なる割合で着色してこの手法をテストし、ダウン症候群またはT 細胞前リンパ球性白血病の患者のゲノムDNAと腎乳頭癌細胞株の細胞に CGH を適用しました。得られた蛍光比率は正確であり、異なる細胞タイプのゲノム DNA 間の違いは検出可能であり、したがって CGH は非常に有用な細胞遺伝学的分析ツールであると結論付けられました。^[6]

当初、CGH技術の普及は困難でした。プロトコルが統一されておらず、特にデータの解釈における不確実性により矛盾が生じていたためです。^[3]しかし、1994年に分かりやすいプロトコルを詳細に説明したレビューが発表され^[7]、画像解析ソフトウェアが市販されたため、CGHは世界中で利用できるようになりました。^[3] マイクロダイセクションや縮重 オリゴヌクレオチドプライミングポリメラーゼ連鎖反応（DOP-PCR）などの新しい技術がDNA産物の生成に利用できるようになると、CGHの概念をより小さな染色体異常に適用できるようになり、CGHの解像度が向上しました。^[3]

従来の中期染色体調製の代わりにDNAマイクロアレイを使用するアレイCGHの実装は、 1997年にSolinas-Tolodoらによって腫瘍細胞を使用して、 ^[8] Pinkelらによって1998年に乳がん細胞を使用して初めて実施されました。^[9]これは、ヒトゲノムプロジェクトによって可能になりました。このプロジェクトでは、ヒトゲノム全体の位置がわかっているクローンDNA断片のライブラリが生成され、これらの断片がDNAマイクロアレイのプローブとして使用されています。 ^{[10]現在、cDNA、ゲノムPCR産物、}細菌人工染色体（BAC）など、さまざまな起源のプローブを、最大200万個のプローブを含めることができるDNAマイクロアレイで使用できます。^[10]アレイCGHは自動化されており、プローブがメタフェーズ標本よりもはるかに小さいため従来のCGHよりも高い解像度（100kbまで）が可能で、必要なDNA量も少なく、必要に応じて特定の染色体領域をターゲットにすることができ、順序付けられているため分析が速く、診断用途に非常に適応しやすい。^{[10] [11]}

スライド上のDNAは参照サンプルであり、核型が正常な男性または女性から採取されるが、男性のY染色体よりもはるかに多くの遺伝情報を含む2つのX染色体を持つ女性のDNAを使用することが好ましい。フィトヘマグルチニン刺激末梢血リンパ球を使用する。ヘパリン処理血液1mLを培養培地10mlに加え、5% CO2の雰囲気下で37℃で72時間培養する_。コルヒチンを加えて細胞の有糸分裂を停止させ、細胞を採取して低張塩化カリウムで処理し、3:1メタノール/酢酸で固定する。^[3]

次に、細胞懸濁液を 1 滴、エタノールで洗浄したスライドに約 30 cm の距離から滴下します。これは、室温、湿度 60～70% で実施するのが最適でしょう。スライドは位相差顕微鏡を使用して視覚化して評価する必要があります。細胞質は最小限で、染色体は重なっていないこと、分離された染色分体がなく 400～550 本のバンドの長さであること、そして最終的に光沢ではなく暗色に見えることが確認されるはずです。その後、スライドは室温で一晩風乾する必要があります。その後、乾燥状態を維持するために、4 枚ずつ -20 °C でシリカビーズまたは窒素を存在させて保管する必要があります。ハイブリダイゼーションは変化する可能性があるため、異なるドナーをテストする必要があります。市販のスライドを使用することもできますが、必ず最初にテストする必要があります。^[3]

標準的なフェノール抽出法は、試験組織または参照組織（核型が正常な個体）からDNAを抽出するために使用され、トリス-エチレンジアミン四酢酸とフェノールを等量ずつ水性DNAと混合する 。その後、撹拌と遠心分離によって分離し、その後、水性層を除去してエーテルでさらに処理し、最後にエタノール沈殿法でDNAを濃縮する。^[3]

市販のアフィニティーカラムをベースにしたDNA分離キットを使用して完了することもできます。^[3]

最高品質のDNAは新鮮な組織または凍結組織から抽出するのが望ましいが、適切な手順に従えば、ホルマリン固定またはパラフィンワックスで包埋されたアーカイブ材料を使用することもできる。CGH実験には0.5～1μgのDNAで十分だが、必要な量が得られない場合はDOP-PCRでDNAを増幅することができるが、その場合、信頼性を高めるためにテストDNAサンプルと参照DNAサンプルの両方にDOP-PCRを適用することが重要です。^[3]

ニックトランスレーションはDNAを標識するために使用され、DNAを切断し、蛍光体で標識されたヌクレオチド（直接標識）またはビオチンまたはオキシゲニンで置換し、後で蛍光体結合抗体を追加します（間接標識）。次に、ゲル電気泳動でテストDNAと参照DNAの両方の断片長を確認することが重要です。最適なハイブリダイゼーションのためには、断片長が500kb〜1500kbの範囲内にある必要があります。^[3]

ライフテクノロジーズ社のラベルなしCot-1 DNA（長さ50bp-100bpの反復配列を豊富に含む胎盤DNA）が添加され、特にセントロメアとテロメアにおける通常の反復DNA配列をブロックします。これらの配列が検出されると、蛍光比が低下し、検出を逃れる増幅または損失が発生する可能性があるためです。^[3]

標識された試験DNAと標識された参照DNAをそれぞれ8～12μlずつ混合し、40μgのCot-1 DNAを加えて沈殿させ、その後、DNAの融解温度を下げるために50%のホルムアミドと、pH7.0のクエン酸ナトリウム（SSC）溶液中の有効プローブ濃度を高めるために10%のデキストラン硫酸を含む6μlのハイブリダイゼーションミックスに溶解する。^[3]

スライドとプローブの変性は別々に行われます。スライドは70%ホルムアミド/2xSSCに72℃で5～10分間浸漬し、プローブは80℃のウォーターバスに10分間浸漬して変性させ、すぐにメタフェーズスライド標本に加えます。この反応物をカバーガラスで覆い、40℃の湿潤チャンバーで2～4日間放置します。^[3]

次にカバーガラスを取り除き、室温で 2xSSC で 3 回、0.1xSSC で 45 °C で 1 回、室温で TNT で 1 回、合計 5 分間洗浄します。反応物を 10 分間プレインキュベートし、続いて 60 分間、37 °C でインキュベートし、TNT で 5 分間洗浄を 3 回、室温で 2xSSC で 1 回行います。次に、スライドを 70%/96%/100% のエタノール シリーズで乾燥させ、染色体同定のために DAPI (0.35 μg/ml) で対比染色し、カバーガラスで密封します。^[3]

視覚化には、 DAPI染色と 2 つの蛍光体に適したフィルターを備えた蛍光顕微鏡が必要です。これらのフィルターは、狭帯域通過フィルターなど、蛍光体間のクロストークを最小限に抑えるものでなければなりません。顕微鏡は、色の変化のない均一な照明を提供し、適切に調整され、アポクロマートで倍率が x63 または x100 の「プラン」タイプの対物レンズを備えている必要があります。 ^[3]

画像は、標本レベルで少なくとも0.1μmの空間分解能を持ち、少なくとも600×600ピクセルの画像が得られるカメラを使用して記録する必要があります。また、カメラは、最低8ビットの測光解像度で、少なくとも5〜10秒間画像を積分できなければなりません。^[3]

画像処理ステップには、専用の CGH ソフトウェアが市販されており、バックグラウンド ノイズの減算、染色体由来ではない物質の除去とセグメント化、蛍光比の正規化 、インタラクティブな核型分析、標準長への染色体のスケーリングを行う必要があります。欠失または増幅の染色体領域を示す「相対コピー数核型」は、多数の高品質メタフェーズの比率を平均化し、それらを表意文字 (バンド パターンに基づいて染色体を識別する図) に沿ってプロットすることによって生成されます。比率プロファイルの解釈は、固定しきい値または統計しきい値 (信頼区間) を使用して行われます。信頼区間を使用する場合、蛍光比の 95% に 1.0 が含まれていない場合に、増加または減少が識別されます。^[3]

DNAに関わるあらゆるステップ、特に検査DNAの汚染を避けるよう細心の注意を払う必要がある。サンプルが正常なDNAで汚染されると結果が1.0に近づき、異常が検出されない可能性がある。結果を確認するためにFISH、PCR 、フローサイトメトリー実験が用いられることがある。^{[4] [12]}

アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（マイクロアレイベースの比較ゲノムハイブリダイゼーション、マトリックスCGH、アレイCGH、aCGHとも呼ばれる）は、ゲノム全体にわたる高解像度のスケールで染色体コピー数の変化を検出するための分子細胞遺伝学的手法です。 ^[13]アレイCGHは、従来のCGHと同じ競合的蛍光in situハイブリダイゼーションの原理を利用して、患者のゲノムを参照ゲノムと比較し、2つのゲノムの違いを特定し、患者のゲノム不均衡の領域を特定します。

アレイCGHの導入により、従来のCGHの主な限界である解像度の低さが克服されました。アレイCGHでは、染色体の正確な位置がわかっているクローンDNA断片（+100～200 kb）にメタフェーズ染色体が置き換えられます。これにより、異常をより詳細に検出できるようになり、さらに、変化をゲノム配列に直接マッピングすることも可能になります。^[14]

アレイCGHは、特異的で感度が高く、高速でスループットの高い技術であることが証明されており、DNAコピー数変化の分析に使用される他の方法と比較してかなりの利点があり、診断アプリケーションに適しています。この方法を使用すると、DNA配列の5〜10キロベースのレベルでコピー数の変化を検出できます。 ^[15] 2006年現在、高解像度CGH（HR-CGH）アレイでも、 200 bpの解像度で構造変異（SV）を正確に検出できます。^{[16]この方法により、}がんや染色体異常による先天性欠損などの人間の状態における微小欠失や重複などの新しい反復性染色体変化を特定できます。 ^{[アップデート]}

アレイCGHは、従来のCGHと同じ原理に基づいています。どちらの技術でも、参照（またはコントロール）サンプルのDNAとテスト（または患者）サンプルのDNAは、2つの異なる蛍光体で差別的に標識され、核酸ターゲット に競合的に共ハイブリダイズするプローブとして使用されます。従来のCGHでは、ターゲットは参照メタフェーズスプレッドです。アレイCGHでは、これらのターゲットは、さまざまなベクター（ BACやプラスミドなど）、cDNA、またはオリゴヌクレオチドにクローニングされたゲノム断片です。^[17]

図 2. ^[14]はアレイ CGH 技術の概略図である。検査対象サンプルの DNA は赤色蛍光体 (シアニン5) で標識され、参照 DNA サンプルは緑色蛍光体 (シアニン 3) で標識される。2 つの DNA サンプルを等量混合し、数千個の均等間隔で配置されたクローン DNA 断片またはオリゴヌクレオチドの DNA マイクロアレイに共ハイブリダイズし、アレイ上に 3 重にスポットする。ハイブリダイゼーション後、デジタル画像化システムを使用して、ハイブリダイズした各蛍光体の相対的な蛍光強度を捕捉し、定量化する。^[17]結果として得られる蛍光強度の比は、検査ゲノムと参照ゲノムの DNA 配列のコピー数の比に比例する。1 つのプローブ上の蛍光色素の強度が等しい場合、患者のゲノムのこの領域には検査サンプルと参照サンプルの DNA が等量含まれていると解釈される。 Cy3:Cy5比が変化している場合は、その特定のゲノム領域における患者のDNAの損失または増加を示します。^[18]

アレイ CGH は、さまざまな技術を使用して実装されています。したがって、アレイ CGH の利点と制限の一部は、選択した技術に依存します。初期のアプローチでは、BACなどの大きな挿入ゲノム DNA クローンから作成されたアレイが使用されました。BAC を使用すると、単一コピーの変化を検出し、異常境界を正確に特定するのに十分な強度の信号が得られます。ただし、分離された BAC クローンの初期 DNA 収量が低いため、DNA 増幅技術が必要です。これらの技術には、ライゲーション介在ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)、1 つまたは複数のプライマーセットを使用した縮重プライマー PCR、およびローリングサークル増幅が含まれます。^[19] cDNA を使用してアレイを構築することもできます。これらのアレイは現在、高い空間解像度を実現していますが、cDNA の数は染色体にコード化されている遺伝子によって制限され、クロスハイブリダイゼーションのために感度が低くなります。^[14]この結果、ゲノム全体の規模で単一コピーの変化を検出できなくなります。^[20]最新のアプローチは、短いオリゴヌクレオチドでアレイをスポットすることです。オリゴの量はほぼ無限であり、処理は迅速で、費用対効果が高く、簡単です。オリゴヌクレオチドは単一のコピーの変化を検出する感度を持っていませんが、染色体上で互いに隣接してマッピングされるオリゴからの比率の平均化により、低下した感度を補うことができます。^[21]また、特定のブレークポイントを明らかにするために、重複したプローブを持つアレイを使用することも可能です。

CGH アプリケーション用のマイクロアレイの設計には、全ゲノムとターゲットの 2 つのアプローチがあります。

全ゲノムアレイは、ヒトゲノム全体をカバーするように設計されています。これらには、ゲノム全体を広範囲にカバーするクローンや、ゲノムの範囲内で連続的にカバーするアレイが含まれることがよくあります。全ゲノムアレイは主に研究用途のために構築されており、遺伝子発見において優れた価値を証明しています。また、前例のない解像度でゲノムの DNA 増加と減少をスクリーニングするのにも非常に役立ちます。^[17]

標的アレイは、標的セグメントを評価する目的でゲノムの特定の領域用に設計されています。特定の染色体または染色体セグメントを研究するために、または微小欠失症候群またはサブテロメア再編成が疑われる個人の特定のDNA量異常を特定して評価するために設計される場合があります。医療現場における標的マイクロアレイの重要な目標は、不均衡な細胞遺伝学的異常の診断、遺伝カウンセリング、予後、臨床管理に臨床的に有用な結果を提供することです。^[17]

従来のCGHは、主に腫瘍で繰り返し失われたり増加したりする染色体領域の特定、および癌の診断と予後に使用されてきた。^{[22]このアプローチは、}胎児および新生児ゲノムの染色体異常の研究にも使用できる。さらに、従来のCGHは染色体異常の検出に使用でき、ヒトの遺伝性疾患に関連する複雑な異常の診断に効果的であることが証明されている。^[14]

同じ腫瘍型を対象とした複数の研究から得られた CGH データは、非ランダムな遺伝子異常の一貫したパターンを示しています。^[23]これらの変化の一部は、さまざまな種類の悪性腫瘍に共通しているように見えますが、他の変化はより腫瘍に特異的です。たとえば、染色体領域 1q、3q、8q の増加、および 8p、13q、16q、17p の減少は、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、腎臓がん、膀胱がんなど、多くの腫瘍型に共通しています (図 3)。精巣がんにおける 12p および Xp の増加、膀胱がんにおける 13q の増加 9q の減少、腎臓がんにおける 14q の減少、卵巣がんにおける Xp の減少などの他の変化は、より特異的であり、さまざまな臓器でのがん発生中に作用する独自の選択力を反映している可能性があります。^[23]アレイ CGH は、慢性リンパ性白血病などの B 細胞悪性腫瘍の研究および診断にもよく使用されます。

猫鳴き（CdC）は、5番染色体の短腕が部分的に欠失することで起こる症候群です。^[24]いくつかの研究により、従来のCGHは、この欠失だけでなく、より複雑な染色体異常の検出にも適していることが示されています。たとえば、Levyら（2002）は、CdCの特徴である猫のような鳴き声を持つが、核型が不明瞭な乳児を報告しました。CGH分析により、5p15.3からの染色体物質の損失が明らかになり、臨床的に診断が確定しました。これらの結果は、従来のCGHが構造異常の検出に信頼できる技術であり、特定の症例では複雑な異常の診断に効果的である可能性があることを示しています。^[24]

アレイCGHの用途は主に癌におけるゲノム異常の検出に向けられています。しかし、アレイCGHはヒトの遺伝性疾患を引き起こすDNAコピー数異常の解析にも適しています。^[14]つまり、アレイCGHは欠失、増幅、ブレークポイント、倍数性異常を発見するために使用されます。早期診断は患者にとって有益であり、適切な治療やカウンセリングを受けることで予後を改善できます。^[10]

がんでは遺伝子の変化や再配列が頻繁に起こり、その発症に寄与しています。アレイCGHでこれらの異常を検出することで、重要ながん遺伝子の位置に関する情報が得られ、診断、がんの分類、予後判定に臨床的に活用できます。^[17]しかし、遺伝物質の損失のすべてが病因となるわけではありません。免疫グロブリンサブ遺伝子の再配列中に一部のDNA物質が生理的に失われるためです。最近の研究では、アレイCGHを使用して、乳がんのいくつかのマウスモデルで染色体異常（コピー数変異）の領域を特定し、myc誘導性腫瘍形成中に協力する遺伝子を特定しました。^[25]

アレイCGHは、がんの染色体異常の発見だけでなく、腫瘍の進行のモニタリングにも応用できる可能性がある。アレイCGHで異常が特定されれば、FISHを使用して転移性病変と軽度病変を区別することも可能になる。^{[5] [10]}

プラダー・ウィリー症候群（PWS）は、15q11-13に関係する父親の構造異常であり、同じ領域の母親の異常はアンジェルマン症候群（AS）を引き起こします。どちらの症候群でも、症例の大部分（75%）は、PWS/ASの重要な領域の3～5 Mbの欠失の結果です。^[26]これらの小さな異常は、細胞遺伝学や従来のCGHを使用して検出することはできませんが、アレイCGHを使用すると簡単に検出できます。原理証明として、Vissersら（2003）は、1 Mbの解像度を持つゲノムワイドアレイを構築し、PWSの患者を含む、既知のFISH確認された微小欠失症候群の患者3人をスクリーニングしました。3つの症例すべてで、1.5～2.9 Mbの異常が容易に特定されました。^[27]このように、アレイCGHは、超顕微鏡的異常を検出する特異的かつ感度の高いアプローチであることが実証されました。

オーバーラップマイクロアレイを使用すると、染色体異常に関与するブレークポイントを発見することも可能です。

まだ広く採用されている技術ではありませんが、着床前遺伝子スクリーニングのツールとしてアレイ CGH を使用するという概念は、ますます人気が高まっています。この技術は、着床失敗、流産、ダウン症候群 (21 トリソミー) などの状態につながる可能性のある卵子、精子、または胚のCNV および異数性を検出する可能性があります。このため、アレイ CGH は、人生を変えるような状態の発生を減らし、体外受精の成功率を向上させる有望なツールです。この技術では、単一細胞からの全ゲノム増幅が行われ、その後アレイ CGH 法で使用されます。また、子孫に染色体の不均衡を引き起こす可能性のある、均衡型相互転座やロバートソン転座などの染色体転座を持つカップルにも使用できます。^{[12] [28] [29]}

従来のCGHの主な欠点は、モザイク、均衡型染色体転座、逆位など、コピー数の変化を伴わない構造的染色体異常を検出できないことである。また、CGHは倍数性レベルに対する増加と減少しか検出できない。^[30]さらに、短い反復DNA配列を持つ染色体領域は個人間で大きく異なり、CGH分析を妨げる可能性がある。^[14]したがって、セントロメアやテロメアなどの反復DNA領域は、ラベルなしの反復DNA（Cot1 DNAなど）でブロックする必要があり、スクリーニングから省略することもできます。^[31]さらに、従来のCGHの解像度は、臨床応用を制限する大きな実際上の問題です。CGHは、がんとヒトの遺伝性疾患の両方の研究と診断において有用で信頼性の高い技術であることが証明されていますが、その応用は肉眼的な異常にのみ関係しています。中期染色体の解像度には限界があるため、従来のCGHでは5～10 Mb未満の異常は検出できない。^[23] このような異常を検出するには、高解像度の技術が必要である。アレイCGHはこれらの限界の多くを克服している。アレイCGHは高解像度を特徴とし、これが従来のCGHに対する主な利点である。標準解像度は1～5 Mbだが、アレイに追加のクローンを追加することで約40 kbまで上げることができる。しかし、従来のCGHと同様に、アレイCGHの主な欠点は、コピー数の変化をもたらさない異常を検出できないことと、モザイクを検出する能力が限られていることである。^[14]検出できるモザイクのレベルは、クローンの感度と空間解像度に依存する。現在、約50%の細胞に存在する再編成が検出限界である。このような異常を検出するには、SKY（スペクトル核型分析）やFISHなどの他の技術を使用する必要があります。^[32]

• 細胞遺伝学
• 仮想核型

• バーチャル グランド ラウンド: 「マイクロアレイ技術の差別化と関連する臨床的影響」 (Arthur Beaudet 医学博士)
• arrayMap リポジトリ: アレイごとおよび集約されたデータの視覚化を備えた、継続的に拡張された癌ゲノムアレイ データセットのコレクション (約 64,000 アレイ、2014 年 9 月)。
• 以前の NCBI の Cancer Chromosomes リソースは廃止されました。