アンチセンスRNA

アンチセンスRNA（asRNA ）は、アンチセンス転写産物^[1]、 天然アンチセンス転写産物（NAT）^{[2] [3] [4]}、またはアンチセンスオリゴヌクレオチド^[5]とも呼ばれ、タンパク質をコードするメッセンジャーRNA （mRNA）と相補的な一本鎖RNAであり、ハイブリダイズすることでタンパク質への翻訳を阻害します。asRNA（天然に存在する）は、原核生物と真核生物の両方で発見されており、^[1]、短い（<200ヌクレオチド）および長い（>200ヌクレオチド）非コードRNA（ncRNA）に分類できます。^[4] asRNAの主な機能は、遺伝子発現の調節です。asRNAは合成することもでき、遺伝子ノックダウンの研究ツールとして広く使用されています。治療用途もある可能性があります。^{[6] [1] [4]}

最も初期の asRNA のいくつかは、機能性タンパク質の調査中に発見されました。その一例がmicF asRNAです。大腸菌の外膜ポリンompCの特性を解析しているときに、観察された ompC プロモーター クローンのいくつかは、ompF などの他の膜ポリンの発現を抑制できることが分かりました。この抑制機能に関与する領域は、ompC プロモーターの上流の 300 塩基対の遺伝子座であることがわかりました。この 300 塩基対の領域は、 ompF mRNA の5' 末端と配列が 70% 相同であるため、この 300 塩基対の遺伝子座の転写産物は ompF mRNA と相補的でした。後に、micF と表記されるこの転写産物は ompF の asRNA であり、ompF mRNA と二重鎖を形成することで、ストレス下で ompF の発現をダウンレギュレーションできることが分かりました。これにより、ompF mRNA の分解が誘導されます。^[2]

偶然発見された micF RNA とは異なり、asRNA の大部分は、ゲノム全体の小さな調節 RNA の検索とトランスクリプトーム解析によって発見されました。従来、最初のステップでは、asRNA の既知の特性に基づいた計算による予測が行われます。計算による検索では、エンコード領域は除外されます。保存された RNA 構造を持ち、オーファンプロモーターおよびRho 非依存ターミネーターとして機能すると予測される領域が、解析中に優先されます。計算による検索は遺伝子間領域に焦点を当てているため、エンコード遺伝子の反対の鎖から転写された asRNA は、この方法を使用すると見逃される可能性があります。エンコード領域から転写された asRNA を検出するために、オリゴヌクレオチドマイクロアレイを使用できます。この方法では、エンコード遺伝子の 1 つまたは両方の鎖をプローブとして使用できます。計算による検索とマイクロアレイに加えて、cDNA クローンの配列決定やプロモーター要素のマッピングによって発見された asRNA もあります。^[7]上記のアプローチから得られた多くの知見から、多くの可能性のあるasRNAが生み出されましたが、さらなる機能テストによって実際のasRNAであることが証明されたのはほんのわずかでした。偽陽性の結果の数を最小限に抑えるために、近年の新しいアプローチでは、鎖特異的転写、クロマチン結合非コードRNA、および単一細胞研究に焦点が当てられています。^[1]

asRNA を薬剤標的とするアイデアは、1978 年にザメクニックとスティーブンソンが、ラウス サルコーマ ウイルスのウイルス RNA に対するアンチセンス オリゴヌクレオチドを発見したときに始まりました。このオリゴヌクレオチドは、ウイルスの複製とタンパク質合成を阻害する能力がありました。それ以来、asRNA を薬剤候補として開発するために多くの努力が払われてきました。1998 年には、最初の asRNA 薬剤であるフォミビルセンが FDA に承認されました。21 塩基対のオリゴヌクレオチドであるフォミビルセンは、エイズ患者のサイトメガロウイルス網膜炎の治療薬として開発されました。この薬剤は、ウイルスの転写された mRNA を標的とし、その結果としてサイトメガロウイルスの複製を阻害します。フォミビルセンは市場を失ったため 2004 年に製造中止になりましたが、asRNA を薬剤標的または薬剤候補として使用する成功例であり、刺激的な例となりました。^[5]

asRNA を治療薬として使用する別の例としては、2013 年に FDA の承認を受けたミポメルセンが挙げられます。ミポメルセンは、まれな常染色体優性遺伝病であるホモ接合性家族性高コレステロール血症 (HoFH) 患者の低密度リポタンパク質コレステロール(LDL) レベルを管理するために開発されました。HoFH では総コレステロール (650～1000 mg/dL) と LDL 受容体 (600 mg/dL 以上) のレベルが高いため、HoFH 患者は冠動脈疾患のリスクが高くなります。タンパク質アポ B-100 は超低密度リポタンパク質(VLDL) と LDL の生成に必要であることが判明しているため、ミポメルセンはアポ B-100 の mRNA を補完し、それをRNase H依存性分解の対象とします。最終的に、ミポメルセンは LDL レベルを低下させることができます。^[8]

最初に発見された asRNA は、プラスミド、バクテリオファージ、細菌などの原核生物に存在していました。たとえば、プラスミド ColE1 では、RNA I と呼ばれる asRNA が、複製を制御することでプラスミドのコピー数を決定する重要な役割を果たしています。ColE1 の複製は、RNA II と呼ばれるプライマー RNA の転写に依存しています。RNA II は転写されると、DNA テンプレートにハイブリダイズし、その後 RNase H によって切断されます。asRNA RNA I の存在下では、RNA I と RNA II が二重鎖を形成し、RNA II の構造変化を引き起こします。その結果、RNA II は DNA テンプレートとハイブリダイズできず、ColE1 のコピー数が低下します。バクテリオファージ P22 では、asRNA sar が Ant の発現を制御することで、溶菌サイクルと溶原サイクルの制御に役立ちます。^[9] asRNA は原核生物で発現するほか、植物でも発見されました。植物における asRNA 制御の最もよく説明されている例は、 開花遺伝子座 C (FLC)遺伝子です。シロイヌナズナの FLC 遺伝子は 、花の遷移を誘導する一連の遺伝子の発現を防ぐ転写因子をコードしています。寒冷環境では、COOLAIR と表記される FLC 遺伝子の asRNA が発現し、クロマチン修飾を介して FLC の発現を阻害し、結果として開花を可能にします。^[10]もう 1 つのよく研究されている例は、DOG1 (発芽遅延 1) 遺伝子です。その発現レベルは、シスで作用するアンチセンス転写 (asDOG1 または 1GOD) によって負に制御されます。^[11]哺乳類細胞における asRNA 制御の典型的な例は、X 染色体の不活性化です。asRNAであるXist は、ポリコーム抑制複合体 2 (PRC2)をリクルートし、X 染色体のヘテロクロマチン化を引き起こします。^[3]

アンチセンスRNAはさまざまな方法で分類できます。制御メカニズムの観点から、一部の著者はasRNAをRNA-DNA相互作用、核または細胞質でのRNA-RNA相互作用、およびRNA-タンパク質相互作用（エピジェネティック）に分類しています。^[3]アンチセンスRNAは、asRNAの発現を開始するプロモーターの種類（独立プロモーター、共有双方向プロモーター、または潜在的プロモーター）によって分類できます。長さの観点から、asRNAは一般にlncRNAに分類されますが、長さが200塩基対未満の短いasRNAもあります。asRNAの制御メカニズムは種特異的であることが判明しているため、asRNAは種によっても分類できます。^{[1] asRNAを分類する一般的な方法の1つは、asRNAが標的遺伝子に対して転写される場所（}シス作用型とトランス作用型）によるものです。^[要出典]

シス作用性asRNA は、標的遺伝子座で標的遺伝子の反対鎖から転写される。それらはしばしば標的遺伝子と高度または完全な相補性を示す。シス作用性 asRNA が mRNA を標的にして遺伝子発現を制御する場合、個々の mRNA のみを標的とすることができる。標的 mRNA と相互作用すると、シス作用性 asRNA はリボソーム結合をブロックするか、標的 mRNA を分解するためにRNAaseをリクルートすることができる。その結果、これらのシス作用性 asRNA の機能は、標的 mRNA の翻訳を抑制することである。 ^{[2] mRNA を標的とするシス作用性 asRNA の他に、シス作用性エピジェネティック}サイレンサーとアクチベーターがある。アンチセンス RNA は、赤痢アメーバの LINE1-ORF2 ドメインの翻訳を抑制することが示されている。しかし、それがシス作用性かトランス作用性かはまだ確認されていない。^[12]

エピジェネティック修飾の観点から見ると、シス作用とは、転写される遺伝子座の周囲のエピジェネティック変化を制御するこれらのasRNAの性質を指します 。個々のmRNAを標的とする代わりに、これらのシス作用性エピジェネティック調節因子は、転写遺伝子座と隣接する遺伝子の両方に影響を及ぼすことができるクロマチン修飾酵素をリクルートすることができます。^[3]

トランスアクティングasRNA は、標的遺伝子から遠い遺伝子座から転写されます。シスアクティング asRNA とは対照的に、標的遺伝子との相補性は低いですが、シスアクティング asRNA よりも長くなることがあります。また、複数の遺伝子座を標的にすることもできます。トランスアクティング asRNA のこれらの特性により、標的転写産物との複合体の安定性が低くなり、機能を発揮するために Hfq などの RNAシャペロン タンパク質の助けが必要になる場合があります。トランスアクティング asRNA の複雑さのため、現在、薬物治療の標的としては適していないと考えられています。^[2]

asRNA の多くの例は、エピジェネティックな修飾を介して転写開始に対する阻害効果を示しています。

DNAメチル化は、特定の遺伝子の長期的なダウンレギュレーションを引き起こす可能性があります。asRNA誘導DNAメチル化を介した機能タンパク質の抑制は、いくつかのヒト疾患で確認されています。ヘモグロビンレベルの低下により組織内の酸素不足につながる血液疾患の一種であるα-サラセミアのクラスでは、 ^[13] ヘモグロビンα1遺伝子（HBA1）は、HBA1のasRNAとして機能し、HBA1プロモーターのメチル化を誘導する推定RNA結合タンパク質Luc7-like（LUC71）の異常な転写によってダウンレギュレーションされます。^[1]別の例としては、急性リンパ性白血病および急性骨髄性白血病における腫瘍抑制遺伝子p15INK4b（CDKN2Bとも呼ばれる）のサイレンシングがあります。このサイレンシング効果の原因となるasRNAは、INK遺伝子座（ANRIL）のアンチセンス非コードRNAであり、p15INK4bをコードする同じ遺伝子座で発現しています。^[3]

真核細胞では、 DNA はヒストンによって密集しています。ヒストンの修飾は DNA との相互作用を変え、さらに遺伝子発現の変化を誘発する可能性があります。ヒストンのメチル化の生物学的影響は状況に依存します。一般的に、ヒストンのメチル化は遺伝子抑制につながりますが、遺伝子活性化も達成できます。^[14]ヒストンのメチル化は asRNA によって誘発できることが証明されています。たとえば、 ANRIL は DNA メチル化を誘発する能力に加えて、ポリコーム抑制複合体 2 (PRC2)をリクルートしてヒストンのメチル化 (H3K27me) を引き起こすことで、CDKN2Bの隣接遺伝子であるCDKN2Aを抑制することもできます。もう 1 つの典型的な例は、 XISTによる X 染色体の不活性化です。^[1]

ANRIL誘導性エピジェネティック修飾は、シス作用性エピジェネティック制御の一例である。^[3]さらに、アンチセンスRNA誘導性クロマチン修飾はトランス作用性である可能性がある。例えば、哺乳類では、asRNA HOTAIRはホメオボックスC（HOXC）遺伝子座から転写されるが、 PRC2をHOXDにリクルートし、H3K27を沈着させてHOXDをサイレンシングする。HOTAIRは原発性乳がんにおいて高発現している。^[1]

DNA メチル化やヒストンのメチル化などのエピジェネティック制御は、転写の開始を阻害することで遺伝子発現を抑制できます。ただし、時には、転写プロセスを早期に終了または減速させることで遺伝子抑制を達成できます。 asRNA は、このレベルの遺伝子制御に関与できます。たとえば、複雑な RNA ポリメラーゼが存在する細菌または真核細胞では、同じ遺伝子座での双方向転写によりポリメラーゼの衝突が発生し、転写が終了することがあります。弱い転写中にポリメラーゼの衝突が発生する可能性は低い場合でも、ポリメラーゼの一時停止が発生して伸長がブロックされ、遺伝子抑制につながることもあります。その一例が、 asRNA RME2 による IME4 遺伝子の抑制です。転写に共転写的に影響を及ぼす別の方法は、スプライシングをブロックすることです。ヒトの典型的な例の 1 つは、転写抑制因子である E カドヘリンをコードするジンクフィンガーE ボックス結合ホメオボックス 2 遺伝子 ( ZEB2 ) です。 ZEB2 mRNA の効率的な翻訳には、 5' 末端の mRNA イントロンに内部リボソーム進入部位(IRES) が存在することが必要である。ZEB2 の asRNA が発現すると、スプライシング部位がマスクされ、mRNA 内の IRES が維持され、E-カドヘリンが効率的に合成される。最後に、asRNA 発現レベルに応じて、センス転写の異なるアイソフォームが生成される可能性があります。したがって、asRNA 依存性調節はオン/オフ機構に限定されず、むしろ細かいトーン制御システムを提示します。^[1]

asRNA による直接的な転写後調節とは、mRNA が asRNA によって直接標的とされることを指し、その結果、翻訳が影響を受ける。このタイプの asRNA のいくつかの特性は、シス作用およびトランス作用 asRNA で説明されている。このメカニズムは、標的 mRNA とその asRNA の両方が同じ細胞内に同時に存在する必要があるため、比較的高速である。シス作用 asRNA で説明されているように、mRNA-asRNA のペアリングにより、リボソームへの進入が阻害され、RNase H 依存性分解が起こる可能性がある。全体として、mRNA を標的とする asRNA は、センス mRNA の翻訳を活性化または阻害することができ、阻害効果が最も豊富である。^[1]

調節要素としての asRNA は、薬剤ターゲットとして考えられる多くの利点を持っています。まず、asRNA は、転写、転写後、エピジェネティック修飾を含む複数のレベルで遺伝子発現を制御します。次に、シス作用 asRNA は配列特異的であり、標的遺伝子と高度な相補性を示します。^[1]第三に、asRNA の発現レベルは標的 mRNA の発現レベルと比較して非常に小さいため、効果を発揮するために必要な asRNA の量はわずかです。薬剤ターゲットの観点からは、効果を発揮するために必要な投与量が少ないため、これは大きな利点となります。^[4]

近年、遺伝子座特異的に遺伝子発現を高めるために asRNA を標的とするアイデアが注目を集めています。医薬品開発の性質上、ダウンレギュレーターまたは阻害剤として機能する医薬品の方が常に簡単です。しかし、腫瘍抑制遺伝子、神経保護成長因子、特定のメンデル遺伝病でサイレンシングされている遺伝子などの遺伝子発現を活性化またはアップレギュレーションできる医薬品の開発が必要です。現在、欠損した遺伝子発現またはタンパク質機能を回復するためのアプローチには、酵素補充療法、マイクロ RNA療法、および機能的 cDNA の送達が含まれます。ただし、それぞれに欠点があります。たとえば、酵素補充療法で使用される合成タンパク質は、内因性タンパク質の機能全体を模倣できないことがよくあります。さらに、酵素補充療法は生涯にわたる取り組みであり、患者に大きな経済的負担をもたらします。 asRNAの遺伝子座特異的性質と多くの疾患におけるasRNA発現の変化の証拠のため、asRNAを阻害し、最終的に特定の遺伝子発現を増加させるために、antagoNATと呼ばれる一本鎖オリゴヌクレオチドを設計する試みがなされてきました。^[4]

asRNAは薬物標的または薬物候補として期待されているが、解決すべき課題がいくつか残っている。^[15]まず第一に、asRNAとantagoNATはRNaseまたは他の分解酵素によって容易に分解される可能性がある。治療用オリゴヌクレオチドの分解を防ぐためには、通常、化学修飾が必要となる。オリゴヌクレオチドに対する最も一般的な化学修飾は、バックボーンにホスホロチオエート結合を追加することである。 ^[5]しかし、ホスホロチオエート修飾は炎症誘発性となる可能性がある。ホスホロチオエート修飾オリゴヌクレオチドを局所注射すると、発熱、悪寒、吐き気などの副作用が観察されている。第二に、オフターゲット毒性も大きな問題である。内因性asRNAの遺伝子座特異的な性質にもかかわらず、合成オリゴヌクレオチドのうち期待される標的効果を示したのはわずか10～50%であった。この問題の原因として考えられるのは、asRNAの構造が標的配列とRNase Hに認識されるために高い要件があることです。1つのミスマッチでも二次構造に歪みが生じ、オフターゲット効果につながる可能性があります。^[4]最後に、人工asRNAは細胞内への取り込みが限られていることが示されています。^[5]ニューロンとグリアは裸のアンチセンスオリゴヌクレオチドを自由に取り込む能力があることが示されていますが、ウイルスや脂質小胞などの追跡可能なキャリアは、細胞内濃度と代謝を制御および監視するのに依然として理想的です。^[4]

• シス天然アンチセンス転写