トランスラトミクス

トランスラトミクスは、細胞または生物で活発に翻訳されているすべてのオープンリーディングフレーム（ORF）の研究です。このORFのコレクションはトランスラトームと呼ばれます。細胞のトランスラトームを特徴付けると、細胞内でアクティブな生物学的経路の配列に関する洞察が得られます。分子生物学のセントラルドグマによれば、細胞内のDNAは転写されてRNAが生成され、次にRNAが翻訳されてタンパク質が生成されます。何千ものタンパク質が生物のゲノムにコード化されており、細胞内に存在するタンパク質は協力して多くの機能を実行し、細胞の生命を支えています。ストレス時や発達の特定の時点など、さまざまな条件下では、細胞がアクティブになるために異なる生物学的経路が必要になる場合があり、したがって異なるタンパク質のコレクションが必要になります。固有の条件と環境条件に応じて、一度に作られるタンパク質のコレクションは異なります。トランスラトミック技術は、活発に翻訳されているORFのコレクションの「スナップショット」を撮るために使用することができ、これにより、現在の条件下で細胞がどの生物学的経路を活性化しているかに関する情報が得られます。^[1]

通常、リボソームプロファイリング技術は、トランスラトーム情報を取得するために使用されます。^[2]単一細胞リボソームプロファイリングなどの最近の進歩により、これらの研究の解像度が大幅に向上し、研究者は個々の細胞レベルで翻訳に関する洞察を得ることができます。^[3]これは、全体的なバルク測定ではタンパク質合成における重要な細胞間の違いが隠れてしまう可能性がある不均一な細胞集団にとって特に重要です。他の方法としては、ポリソームプロファイリング、全長翻訳mRNAプロファイリング（RNC-seq）、翻訳リボソームアフィニティー精製（TRAP-seq）があります。^[4]トランスクリプトームとは異なり、トランスラトームは、プロテオームとトランスラトームの相関がトランスクリプトームとプロテオームの相関よりも高いため、一部の遺伝子の発現レベルを推定するためのより正確な近似値です。 ^[5]

ヒトゲノム計画の完了が近づくにつれ、遺伝学の分野は遺伝子の機能の解明へと焦点を移していった。これには、細胞内のRNAやタンパク質など、他の生物学的物質のコレクションのカタログ化も含まれた。これらの物質のコレクションは「-オーム」と呼ばれ、ヒトゲノムの配列決定をめぐる幅広い興奮を呼び起こした。トランスラトームという用語は、2001年にグリーンバウムらによって初めて提唱された。^{[6]トランスラトームは、}プロテオーム内のタンパク質の相対的な量を説明することを目的としていた。トランスラトームという用語は現在、一般的に細胞内で活発に生成されているタンパク質のコレクションを指す。トランスラトミクスは、デグラドミクスと組み合わせて、さまざまな条件下でのプロテオームの正味の変化を説明することを目指している。

ゲノミクスの目的は、ゲノム、つまり生物の遺伝物質の集まりを研究することです。ゲノミクスのサブフィールド、またはトランスクリプトミクスやプロテオミクスなどの他のオミクスは、さまざまな条件下でのゲノムの産物 (RNA やタンパク質など) を定量化することで、ゲノムの機能の特徴を明らかにすることを目的としています。そうすることで、オミクスは遺伝子発現のさまざまなレベルの調節、ひいてはゲノムの機能についての洞察を得ます。ただし、これらの分野では、すでに形成された生体分子の特徴を明らかにします。場合によっては、RNA またはタンパク質の存在量は機能を反映しません。これは、これらの生体分子が急速に分解される場合や、最初に合成されてから長期間細胞内に残る場合があるためです。プロテオームの研究にプロテオミクス技術を使用する場合、翻訳後修飾およびタンパク質分解のレベルでのタンパク質の存在量の調節により、それ以前の調節プロセスが不明瞭になる可能性があります。細胞機能は翻訳レベルで制御されることが多く、トランスクリプトームが必ずしもゲノム機能を反映するわけではないため、^[1]トランスラトミクス技術を使用してトランスラトームを研究することで、トランスクリプトミクスやプロテオミクス研究では不明瞭になるゲノム機能の制御を観察できる可能性があります。

ほとんどのトランスラトミクス技術は、リボソームと複合して翻訳される mRNA の特性評価に重点を置いています。

ポリソームプロファイリングは、1つまたは複数のmRNAの翻訳の程度を特徴付けるために使用される技術です。高度に翻訳されたmRNAはポリソームとして存在し、つまり複数のリボソームと複合体を形成しています。翻訳レベルが低いmRNAは、より少ないリボソームと複合体を形成します。ポリソームプロファイリングでは、ショ糖勾配を使用して、細胞溶解物中の分子複合体をサイズに基づいて分離します。^[7]カラムからの画分は、シーケンシングまたはその他の方法で分析されます。mRNAの翻訳率は、低分子量および高分子量画分におけるmRNAの検出と存在量に基づいて決定されます。

全長mRNAの翻訳（RNC-seq）には、ショ糖クッション上で溶解サンプルを遠心分離する工程が含まれます。これにより、リボソーム新生鎖複合体（RNC）を遊離mRNAやその他の細胞成分から分離できます。RNCは遠心分離でペレットを形成し、さらなる分析のために収集されます。これらのRNCで翻訳されているmRNAは配列決定することができ、その時点で翻訳されているmRNAの識別と定量化が可能になります。^{[1] [8]}しかし、RNC-mRNA複合体は壊れやすいため、リボソームがmRNAから解離してmRNAが分解し、収集された結果に偏りが生じる可能性があります。^[1]

リボソームプロファイリングでは、ポリソームを含む細胞mRNAがRNAを切断する酵素であるリボヌクレアーゼにかけられます。リボソームに結合したRNA分子の位置は消化から保護されています。リボヌクレアーゼの活動が停止した後、これらの保護された部位を回復して配列決定することができます。したがって、リボシーケンスから得られた配列は、活発に翻訳されていたmRNAの断片を表しています。^[9]

TRAP-seqは、組織またはその他の細胞群内の特定の細胞型で活発に翻訳されているmRNAを識別するために使用されます。対象の細胞型は、緑色蛍光タンパク質などのエピトープタグに融合したリボソームサブユニットを発現するように設計されます。^{[10]細胞溶解後、エピトープを標的とする抗体を使用して、融合タンパク質を含むリボソームに結合したmRNAを単離します。次に、このRNAは}cDNAに変換され、配列決定されます。この技術は、対象の細胞型で翻訳されていたmRNAを具体的に識別します。

質量分析法では新生ポリペプチドの折り畳み状態を判定することはできない。現在、細胞全体における新生ポリペプチドの折り畳み状態を調べる方法は存在しない。個々の新生ポリペプチドの折り畳み状態を調べる方法はある。^[1]

一つの方法は、非特異的プロテアーゼを使用して低温で新生ペプチドを切断する。プロテアーゼは折り畳まれていない柔軟な領域を切断できるが、しっかりと折り畳まれた領域を切断することはできない。その後、切断産物を分離して研究し、新生ペプチドの折り畳まれた領域を決定することができる。^{[1] [11]}

新生ポリペプチドの完全な構造を解析するために、核磁気共鳴（NMR）が使用されます。NMRは溶液中の分子の動的な観察を可能にするため、リボソーム-新生鎖複合体（RNC）に使用することができます。リボソームを標識することで、NMRデータを疑わしいリボソーム信号に対してフィルタリングし、新生ポリペプチドの信号を特定することができます。^[12]

新生ポリペプチドの構造を世界規模で調べることは現在のところ不可能ですが、識別と定量化は可能です。

1 つの方法は、細胞培養におけるアミノ酸による安定同位体標識(SILAC)の変種を使用する。SILAC は、定量化を可能にするためにタンパク質を安定同位体で標識し、標識されたペプチドと標識されていないペプチドを比較する。パルス SILAC (pSILAC) では、パルス中に生成されたペプチドのみを標識できる。理論的には、これにより定量化のために新生ペプチドのみを捕捉できる。しかし、SILAC では、正確な定量化のために、標識されたタンパク質と標識されていないタンパク質のレベルが同程度必要である。そのため、pSILAC パルスは翻訳プロセスよりもはるかに長く実行する必要があり、新生ペプチドの定量化は不正確になる。^{[1] [13]}

バイオ直交/定量的非標準アミノ酸タグ付け（BONCAT/QuaNCAT）は、タンパク質にタグを付けるアジドホモアラニン（AHA）を使用します。これにより、MS用に新しく作成されたタンパク質を分離できます。^{[14] [15]}しかし、AHAを使用するには、細胞内メチオニンを事前に枯渇させてAHAを導入する必要があり、細胞にストレスを与え、内部の翻訳ダイナミクスを変える可能性があります。pSILACと同様に、AHA法ではより長いパルスが必要なため、新生ペプチドの定量化における有効性が制限されます。^{[1] [13]}

ピューロマイシン関連新生鎖プロテオミクス（PUNCH-P）は、ピューロマイシン-ビオチン標識を使用して、MS用の新生ポリペプチドを捕捉します。細胞のプロセスを妨げませんが、新生ペプチドを検出する他の方法よりも感度が低くなります。^{[1] [13]}これらの定量化方法に加えて、他のMSベースの方法も研究されています。

mRNAの分解も翻訳プロセスの調節に重要な役割を果たします。

分解のメカニズムを調査するために、キャップされていない転写産物と切断された転写産物のゲノムワイドマッピング（GMUCT）、RNA末端の並列解析（PARE）、およびデグラドームシーケンシングでは、イルミナシーケンシングプラットフォームのT4リガーゼを使用して、キャップが除去されたmRNAをシーケンシングします。T4リガーゼは、遊離の5'一リン酸を持つRNAに連結します。成熟したmRNAは5'キャップを持っているため、基質として結合せず、キャップが除去された分解中のmRNAが結合します。^[16]

5'-モノリン酸化末端シーケンシング（5Pseq）は、キャップされた配列とキャップされていない配列の両方を捕捉し、成熟mRNAと分解産物の両方のシーケンシングを可能にします。これはmRNA分解産物の特定に役立ち、リボソームの停止の研究に使用されます。^{[1] [17]}

これらの方法は、5' から 3' への分解、miRNAを介した切断、およびナンセンスを介した mRNA の分解を研究しますが、3' から 5' への分解やその他の分解メカニズムを測定することはできません。

上記の技術は細胞を溶解する必要があるため、生きた細胞では実行できません。単一分子蛍光共鳴エネルギー移動（smFRET）と新生鎖追跡（NCT）は、蛍光を使用して翻訳活動を追跡します。どちらの方法も、単一のmRNA上のポリペプチドの伸長速度を追跡します。^{[18] [19]}ただし、どちらの技術も高スループットは実現できません。^[1]

転移RNA （tRNA）は翻訳の重要な部分です。tRNAはmRNAを読み取り、リボソームがポリペプチドに組み立てるアミノ酸を運びます。そのため、tRNAの量と種類はタンパク質合成の速度に大きな影響を与えます。^[20] tRNAは他のtRNAと非常によく似ており、一部のtRNA種は1つのヌクレオチドだけ異なります。これと類似した二次構造と三次構造が組み合わさって、異なるtRNA種を区別することが困難になっています。^[1]

2Dゲル電気泳動は、tRNAを分離するのに使用される古典的な方法です。最初に、tRNAは7M尿素で変性され、最初のゲル次元で分離されます。4M尿素により、2番目のゲル次元で追加の分離のために部分的に再折り畳みが可能になります。この方法では、大腸菌で48セット、枯草菌で30セットに分離できましたが、解像度が限られています。2Dゲル電気泳動では、多数の異なるtRNA種を完全に分離することはできず、269個のラットtRNAに対して62個のスポットしか見つかりませんでした。^[21]

高性能液体クロマトグラフィーは、アミノアシル化されたtRNAアイソアクセプターに基づいてtRNAを分離するために使用することができます。この方法ではtRNA種を完全に分離することはできず、コドンを区別することはできませんが、異なる細胞株間の定量的な違いを見つけることはできます。^[21]

質量分析法（MS）は、固有のエンドヌクレアーゼ消化産物に基づいてtRNAを分離するために使用できます。^[22]しかし、これは30種類のtRNAの混合物では解像度が限られており、より大きなtRNAグループではMSの前に分画する必要があります。また、tRNA種の消化パターンに関する事前の知識が必要であるため、deNovo tRNA種の識別には使用できません。^[21]

ハイブリダイゼーションベースのマイクロアレイは、 tRNAの3'CCA保存配列を使用して蛍光プローブを結合します。次に、tRNAの長さをカバーする70〜80ヌクレオチド長のプローブを使用してtRNAを結合します。少なくとも8塩基の違いがあるtRNAはマイクロアレイで区別できますが、違いが小さいtRNAは同じプローブに結合します。^[21]

定量的逆転写リアルタイムPCR（qRT-PCR）は、tRNAomeを識別し定量化するもう1つの方法です。保存された3'CCA配列のプライマーは、すべてのtRNA種の逆転写をプライミングするために使用されます。tRNAヌクレオチドの重度の修飾とtRNA分子の安定性が問題になる可能性があるため、高温と脱メチル化がこれらに対抗するために使用されています。脱メチル化は、重度のメチル化がシーケンシングで誘発するエラーに対抗するためにも使用されています。^[1]

Ribo-tRNA-seqは、翻訳におけるtRNAの役割をより詳細に観察するために開発されました。Ribo-seqと同様に、Ribo-tRNA-seqは、シーケンシングの前にライブラリを準備するためにリボソーム内のtRNA分子を捕捉します^[23]