遺伝子発現のキャップ解析

キャップ解析による遺伝子発現解析（CAGE）は、分子生物学で使用される遺伝子発現解析技術で、生物学的サンプル（トランスクリプトーム）中のメッセンジャーRNA集団の5'末端のスナップショットを作成するために使用されます。mRNAの最初（キャップ​​付き転写産物の5'末端）からの小さな断片（従来は27ヌクレオチド長でしたが、現在はシーケンス技術によってのみ制限されています）が抽出され、cDNAに逆転写され、必要に応じてPCR増幅され、シーケンスされます。CAGEは、2003年に林崎、カルニンチらによって初めて発表されました。^{[ 1 ]} CAGEは、 FANTOM研究プロジェクト 内で広く使用されています。

CAGEの出力は、短いヌクレオチド配列（発現配列タグになぞらえてタグと呼ばれることが多い）とその出現頻度のセットである。CAGEタグのコピー数は、生物学的サンプル中のRNA転写産物の量をデジタル的に定量化する。参照ゲノムを用いることで、研究者は通常、タグが抽出された元のmRNA（したがってどの遺伝子）をある程度の確度で特定することができる。

転写産物の他の部分からタグを取得する類似の手法である遺伝子発現シリアル解析（SAGE）とは異なり、CAGEは主にゲノム内の正確な転写開始部位を特定するために使用されます。この情報によって、研究者は遺伝子発現に必要なプロモーター構造を調査することができます。

CAGEタグは、ゲノムにコードされていない余分なグアニン（G）で始まる傾向があり、これは第一鎖cDNA合成中のテンプレートフリー5'伸長^{[ 2 ]}またはキャップ自体の逆転写^{[ 3 ]}に起因する。 修正されない場合、これは、例えば転写されていない偽遺伝子へのCAGEタグの誤ったマッピングを引き起こす可能性がある^{[ 2 ]} 。一方、このGの追加は、より信頼性の高いTSSピークをフィルタリングするためのシグナルとしても利用された^{[ 4 ] 。}

オリジナルのCAGE法（Shiraki et al. , 2003）^{[ 1 ]}では、5'末端を捕捉するためにCAP Trapper ^{[ 5 ]}、cDNAを合成するためにオリゴdTプライマー、タグを切断するためにII型制限酵素MmeI、そして配列決定のためにサンガー法が用いられていました。

ランダム逆転写プライマーは、非ポリアデニル化RNAをより良く検出するために、 2006年にKodziusら^{[ 6 ]によって導入されました。}

DeepCAGE（Valen et al. , 2008）^{[ 7 ]}では、タグコンカテマーは454「次世代」シーケンシングプラットフォームでより高いスループットでシーケンスされました。

2008年に、DeepCAGEプロトコルにバーコード多重化が追加された（Maeda et al.、2008）。^{[ 8 ]}

nanoCAGE（Plessy et al. , 2010）^{[ 9 ]}では、より少ない総RNA量から分析できるように、CAP Trapperの代わりにテンプレートスイッチング法を用いて5'末端またはRNAを捕捉した。より長いタグは、タイプIII制限酵素EcoP15Iで切断され、連結せずにSolexa（当時はIllumina）プラットフォームで直接シーケンスされた。

酵素タグ切断をスキップし、5' cDNAをペアエンドでシーケンスするCAGEscan法（Plessy et al. , 2010）^{[ 9 ]}は、同じ論文で、新規プロモーターを既知のアノテーションに接続するために紹介されました。

HeliScopeCAGE（Kanamori-Katayama et al. , 2011）^{[ 10 ]}では、 CAPトラップCAGEプロトコルが変更され、酵素タグ切断をスキップして、 PCR増幅なしでHeliScopeプラットフォーム上でキャップされた5'末端を直接シーケンスするようになりました。その後、2012年にItoh et al. ^{[ 11 ]}によって自動化されました。

2012年に、高橋ら^{[ 12 ]}によって標準CAGEプロトコルが更新され、EcoP15Iでタグを切断し、Illumina-Solexaプラットフォームでシーケンスするようになった。

2013年、Batutら^{[ 13 ]}は、プロモーター特異性を最大化するために、RAMPAGEにおいてCAPトラッパー、テンプレートスイッチング、および5'-リン酸依存性エキソヌクレアーゼ消化を組み合わせた。

2014年、村田ら^{[ 14 ]}はnAnTi-CAGEプロトコルを発表した。このプロトコルでは、キャップされた5'末端がPCR増幅やタグ切断なしでIlluminaプラットフォーム上でシーケンスされる。

2017年、Poulainら^{[ 15 ]}はnanoCAGEプロトコルを更新し、多重化のためにタグメンテーション法（ Tn5転移に基づく）を使用するようにした。

2018年、Cvetesicら^{[ 16 ]}は、選択的に分解可能なキャリアRNA（SLIC-CAGE、「超低入力キャリアCAGE」）を導入することにより、CAPトラップCAGEの感度を向上させた。

2021年、高橋ら^{[ 17 ]は}、セカンドストランド合成を省略し、一本鎖cDNAを直接ロードすることで、IlluminaシーケンサーでのCAGEライブラリーのシーケンスを簡素化した（Low Quantity Single Strand CAGE、「LQ-ssCAGE」）。

2025年、Delobelら^{[ 18 ]}はnAnTi-CAGEプロトコルを更新し、独自のデュアルインデックスを導入して、2色Illumina機器で使用されるパターン化されたフローセルでより頻繁に発生するインデックスホッピングアーティファクトを軽減しました。

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• 理化学研究所オミクス科学センターのCAGEホームページ。
• FANTOM5ウェブサイトのプロトコルページ。