対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド

アンチセンスオリゴヌクレオチド( ASO )は、可変ターゲット DNA の配列に相補的な短い合成 DNA です。サザンブロットアッセイ、またはより一般的にはより単純なドットブロットアッセイでターゲットの存在を調べるプローブとして機能します。遺伝子検査、法医学、分子生物学研究 でよく使用されるツールです。

ASO は、通常、長さが 15～21ヌクレオチド塩基のオリゴヌクレオチドです。これは、検査対象の DNA の1 つのバージョンまたは対立遺伝子のみに特異的になるように設計 (および使用) されます。 ^[1] ASO の長さ、どの鎖から選択されるか、およびターゲット DNAに結合する(およびターゲット DNA から洗い流す) 条件はすべて、その特異性に影響します。これらのプローブは通常、ターゲットの遺伝子配列の 1 塩基の差異を検出するように設計できます。これは、遺伝子型分析およびヒトゲノムプロジェクトで重要な一塩基多型(SNP)アッセイの基本機能です。ターゲットに結合した後に検出されるためには、ASO を放射性、酵素、または蛍光タグで標識する必要があります。Illuminaメチル化アッセイ技術は、ASO を利用して 1 塩基対の差異 (シトシンとチミン) を検出し、特定の CpG サイトでのメチル化を測定します。

ヒトの病気である鎌状赤血球貧血は、血液タンパク質βヘモグロビンの6番目のアミノ酸のコドンの遺伝子変異によって引き起こされます。通常のDNA配列GAGはアミノ酸グルタミン酸をコードしますが、変異により中央のアデニンがチミンに変化し、GTG配列（mRNAではGUG）になります。この変化した配列により、最終的なタンパク質がバリンに置き換わり、その構造が歪んでしまいます。

DNA サンプルに変異が存在するかどうかをテストするには、ASO プローブを合成して、変更された配列^[2]に相補的なものにします。ここでは「S」と表記します。対照として、別の ASO を通常の配列「A」用に合成します。各 ASO は、そのターゲット配列に完全に相補的 (強力に結合) ですが、非ターゲット対立遺伝子に対して 1 つのミスマッチがあります (相互作用が弱くなります)。最初の図は、「S」プローブが「S」ターゲット (上) に完全に相補的であるが、「A」ターゲット (下) に対して部分的にミスマッチしている様子を示しています。

サンプル DNA 内のベータヘモグロビン遺伝子のセグメントは PCR によって増幅され、その結果得られた産物はドットブロットとして複製サポート膜に適用されます。サンプルの DNA 鎖はアルカリで分離され、各 ASO プローブは異なるブロットに適用されます。ハイブリダイゼーション後、完全に相補的なハイブリッドと不一致のハイブリッドを区別できる洗浄プロトコルが使用されます。不一致の ASO はブロットから洗い流されますが、一致する ASO (およびそのラベル) は残ります。

2 番目の図では、増幅された DNA の 6 つのサンプルが 2 つのブロットのそれぞれに適用されています。洗浄後に残る ASO ラベルを検出することで、サンプルの遺伝子型を直接読み取ることができます。各サンプルにはベータヘモグロビン遺伝子のコピーが 2 つあります。サンプル 1 と 4 には正常な「A」対立遺伝子のみがあり、サンプル 3 と 5 には「A」対立遺伝子と「S」対立遺伝子の両方があります (したがって、この劣性突然変異のヘテロ接合 キャリアです)。サンプル 2 と 6 には「S」対立遺伝子のみがあり、病気の影響を受けます。示されている少量の「クロスハイブリダイゼーション」は典型的なものであり、最終結果を解釈するプロセスで考慮されます。

ASO 分析は、遺伝子多型を検出するために使用される方法の 1 つにすぎません。直接DNA配列決定は、最初に突然変異を特徴付けるために使用されますが、日常的なスクリーニングには手間がかかりすぎます。以前の方法である制限断片長多型(RFLP) では、事前に配列の変化を知る必要はありませんでしたが、突然変異が制限酵素の切断部位に影響を与える必要がありました。RFLP アッセイは、オリゴヌクレオチドプローブの使用に短期間適応されましたが、^{[3]この技術は、}ポリメラーゼ連鎖反応(PCR) 増幅 DNAの ASO 分析にすぐに取って代わられました。PCR 技術自体は、対立遺伝子特異的 PCRとして、多型の検出に適応されています。ただし、PCR/ASO の組み合わせ法はシンプルで多用途であるため、非放射性ラベルの使用や、ASO プローブを膜に結合させて増幅したサンプル DNA をハイブリダイゼーションに使用する「リバース ドット ブロット」形式など、引き続き使用されています。

遺伝子配列変異の特異的プローブとして合成オリゴヌクレオチドを使用する方法は、カリフォルニア州ドゥアーテのシティ オブ ホープ国立医療センターに勤務していた R. ブルース ウォレスが初めて開発した。1979 年にウォレスと彼の同僚は、一本鎖細菌ウイルスの変異を検出するために ASO プローブを使用したことを報告し^[4]、後にこの技術をクローン化されたヒト遺伝子に適用した。1983 年^[5]と 1985 年^{[2]にウォレスの研究室は、全ゲノム DNA サンプルで}鎌状赤血球貧血の変異を検出したと報告したが、この応用は ASO が運ぶことができるラベルの量が少ないために妨げられた。^[2]

幸いなことに、特定のDNAセグメントを大幅に増幅する方法であるPCRも1985年に報告されました。 ^[3] 1年も経たないうちに、PCRはASO分析と組み合わせられました。^[6]この組み合わせにより、標的DNAの量を100万倍以上増幅できるため、ASOラベリングの問題が解決されました。また、PCRプロセス自体の特異性をASOプローブの特異性に追加できるため、ASOが非標的配列に誤って結合する問題が大幅に軽減されました。この組み合わせは十分に特異的であったため、単純なドットブロットで使用でき、面倒で非効率的なサザンブロット法を回避できました。

ASO-PCRは多発性骨髄腫などの血液がんにおける微小残存病変の検出にも使用されることがある。^[7]

• ASOオートラジオグラムの画像