神経細胞系統マーカー

ニューロン系譜マーカーは、ニューロンなどの神経新生や分化細胞に沿ったさまざまな細胞で発現する内因性のタグです。これにより、さまざまな技術を使用して細胞を検出および識別できます。ニューロン系譜マーカーは、対象の細胞で発現する DNA、mRNA、または RNA のいずれかです。また、部分タンパク質、タンパク質、または異なる細胞タイプまたは共通細胞のさまざまな状態を区別するエピトープなどのタンパク質タグである場合もあります。理想的なマーカーは、正常な状態および/または損傷中の特定の細胞タイプに固有のものです。細胞マーカーは、正常な状態だけでなく病気の際の細胞の機能を調べるための非常に貴重なツールです。特定の細胞に固有のさまざまなタンパク質の発見により、細胞を識別するために使用されている細胞タイプ特異的抗体が生産されました。^[1]

検出には免疫組織化学、免疫細胞化学、転写調節因子および部位特異的リコンビナーゼを用いて特定のニューロン集団を標識する方法、^[2] in situハイブリダイゼーションまたは蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）などが用いられる。^{[3]ニューロン系統マーカーは、ニューロン核に非常に限定されている自己抗体、例えば}Hu によって認識されるニューロン抗原である。免疫組織化学では、抗Huがニューロンの核を染色する。^[4]脳組織内のmRNAの位置を特定するために、DNAまたはRNAの断片をニューロン系統マーカー、すなわちプローブ内の配列に相補的なヌクレオチド配列の存在を検出するハイブリダイゼーションプローブとして使用することができる。この技術はin situハイブリダイゼーションとして知られている。その応用はあらゆる組織で行われてきたが、特に神経科学で有用である。この技術を使用すると、特定の領域内の特定の細胞タイプの遺伝子発現を特定し、この分布の変化が発達を通じてどのように起こり、行動操作と相関するかを観察することが可能になります。^[5]

免疫組織化学は神経細胞の種類を識別するための基本的な方法ですが、コストが比較的低く、脳内の細胞の表現型を区別するのに役立つさまざまな免疫組織化学マーカーが利用できるため、優れた抗体を生成するのに時間がかかることがあります。^[6]したがって、クローン化されたイオンチャネルの発現を迅速に評価するための最も便利な方法の1つは、in situハイブリダイゼーション組織化学である可能性があります。

細胞が組織から分離されるか、多能性前駆細胞から分化されると、結果として得られた集団を特性評価して、目的の集団が得られたかどうかを確認する必要があります。特定の研究の目的に応じて、神経幹細胞マーカー、神経前駆細胞マーカー、ニューロンマーカー、またはPNSニューロンマーカーを使用できます。

神経系の研究は古代エジプトにまで遡るが、より詳細になったのは90世紀に入ってからである。顕微鏡の発明とカミッロ・ゴルジが開発した染色技術により、個々のニューロンを研究することが可能になった。この科学者は、神経組織に銀などの金属を浸透させ始めた。この反応は、クロム酸銀の粒子を神経鞘に固定することから成り、ニューロンの細胞体、軸索、樹状突起に真っ黒な沈着物が生じる。こうして、ゴルジ細胞、ゴルジI、ゴルジIIなど、異なるタイプのニューロンを識別することが可能になった。^{[7] 1885年には、}フランツ・ニッスル というドイツの医学研究者が、現在ニッスル染色として知られる別の染色技術を開発した。この技術は、細胞体と小胞体を染色する点でゴルジ染色とは少し異なる。^[8] 1887年、スペインの科学者サンティアゴ・ラモン・イ・カハールがゴルジ体を用いた染色法を習得し、有名な神経解剖学の研究を始めました。^[9] この技術を用いて、彼は脳のいくつかの領域とさまざまな種について広範囲にわたる研究を行いました。彼はまた、プルキンエ細胞、ニワトリの小脳、げっ歯類の海馬の神経回路を非常に正確に記述しました。 1941年、アルバート・クーン博士は、抗体が組織内の抗原に特異的に結合する原理を使用する革命的な技術を初めて使用しました。彼は、抗体を標識するための免疫蛍光技術を発明しました。^[10] この技術は、さまざまな構造を識別するために神経科学の研究で広く使用され続けています。今日使用されている最も重要な神経マーカーは、GFAP、ネスチン、NeuroD抗体などです。^{[11]過去数年間、}免疫細胞化学や免疫組織化学のための新しい神経マーカーがまだ作成されています。 1953年にハインリッヒ・クリューバーはルクソール・ファスト・ブルー染色（LFB）と呼ばれる新しい染色技術を発明し、この技術により中枢神経系の脱髄を検出することができるようになった。ミエリン鞘は青く染まるが、他の構造も染まる。次の革命的な技術は1969年にジョセフ・G・ガルというアメリカの科学者によって発明された。^[12]この技術はin situ ハイブリダイゼーションは、さまざまな研究で使用されていますが、主に発生生物学で使用されています。この技術を使用すると、動物の特定の領域で発現しているいくつかの遺伝子をマークすることができます。神経生物学では、神経系の形成を理解するのに非常に役立ちます。

これは細胞をマークする最も強力な技術の1つです。この方法は、ラベル付けされた相補的なDNAまたはRNA鎖を組織内の特定のDNAまたはRNAにハイブリダイズさせることで構成されます。このハイブリダイゼーションを行うことで、特定のmRNAの位置を明らかにし、遺伝子の組織化、制御、機能の生理学的プロセスに関する情報を得ることができます。 ^[13]

この技術を使うことで、神経堤の形成や特定の行動など、ある特定のプロセスの背後にある遺伝子やタンパク質が何であるか、またその同じ遺伝子がどこにあるのかを知ることができるようになりました。また、これらの遺伝子の分布の変化が組織の発達にどのように影響するかを確認し、それを行動操作と相関させることもできます。^[13]いくつかの例としては、培養されたニューロンの樹状突起、スパイン、軸索、成長円錐に局在するmRNAの検出のためのジゴキシゲニンまたは蛍光体結合オリゴヌクレオチドプローブの使用、または生体内で樹状突起に局在する少量のmRNAの検出のためのジゴキシゲニン標識RNAプローブと蛍光チラミド増幅があります。^[14]これらの例では、FISH（蛍光in situハイブリダイゼーション）を使用しています。この技術により、生理学的プロセスと神経疾患を理解することができます。

免疫組織化学は、特定のタンパク質に存在する特定の抗原を標的とする蛍光染色タグ付きの抗体を使用する技術です。この高い特異性により、神経組織内のペプチド性および古典的伝達物質化合物、それらの合成酵素、およびその他の細胞特異的抗原の位置を特定できます。

この技術を神経科学に応用した例としては、NGF誘導性大体体外糖タンパク質（NILE-GF）、コリンアセチルトランスフェラーゼ、パルブアルブミン、ニューロフィラメントタンパク質などの抗原の免疫標識が挙げられます。^[15]これらの抗原はすべて、特定の神経細胞型に存在します。これらを使用することで、解剖学的回路を高い解像度で定義し、神経系における一部のタンパク質や細胞の役割、およびそれらのタンパク質や細胞の位置を理解することができます。

これは非常に強力な技術ですが、いくつかの欠点があります。この手順は定量化できない性質があり、偽陽性と偽陰性の両方が発生します。^[16]

免疫細胞化学では免疫組織化学と同じ方法を使用しますが、免疫組織化学は培養中の単離細胞で使用されるのに対し、免疫組織化学は組織で使用されるという違いがあります。結果は同じですが、1 つの細胞だけを調べると解像度が高くなります。

神経幹細胞は、発達中および成人のさまざまな組織に見られる体性幹細胞の一例です。神経幹細胞には2つの基本的な特徴があります。自己複製性があり、最終分裂および分化により、関連する組織内のあらゆる種類の細胞クラスを生み出すことができます。したがって、神経幹細胞は別の神経幹細胞を生み出すか、中枢神経系および末梢神経系に見られる分化細胞タイプ（抑制性および興奮性ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイト）のいずれかを生み出すことができます。^[17]

神経幹細胞を体外で分離する標準的な方法は、もともとNSCの同定に使用されていたニューロスフィア培養システムです。ある程度増殖した後、細胞は、ミトゲンを除去するか、一部の細胞が異なる系統に発達するように誘導する別の因子に細胞をさらすことによって分化するように誘導されます。^[18]細胞の運命は、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ニューロンに特異的な抗原に対する抗体で染色することによって分析されます。場合によっては、細胞を低密度で播種し、単一の細胞が3つの表現型を生じさせることができるかどうかを監視します。^{[19]幹細胞、前駆細胞、成熟したCNS細胞に存在する細胞表面マーカーに対する抗体を使用した} 免疫磁気細胞分離戦略が、NSCの研究に適用されています。その他の非免疫学的方法は、正常および腫瘍形成性CNS組織からの細胞集団を同定するために使用されており、これらの細胞集団は、高アルデヒド脱水素酵素（ALDH）酵素活性など、幹細胞のin vitro特性のいくつかを実証している。ラットおよびマウスの胎児CNSからのALDH細胞は単離されており、in vitroで神経球、ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイトを生成する能力があることが示されており、成体マウスの大脳皮質に移植された場合、in vivoでニューロンを生成する能力があることが示されている。^[18]幹細胞が非対称に分裂すると、より成熟した前駆細胞が生まれ、分化領域に移動する。前駆細胞が移動すると、停止する部位に到達するまでさらに成熟し、静止状態になるか、完全に機能する細胞に分化する。幹細胞を定義するマーカーを同定および発見する上での主な障害は、最も原始的な細胞はおそらく静止状態にあり、多くの固有の抗原を発現しないことである。したがって、造血などの他の分野と同様に、中枢神経系幹細胞をより適切に定義するには、陽性マーカーと陰性マーカーの組み合わせが必要になります。^[19] それにもかかわらず、特定の分子の発現レベルの変化は、特定の神経系統へのさらなる分化に焦点を当てた研究で神経幹細胞の存在を示すために使用できます。神経幹細胞に使用される通常のマーカーには、ネスチンとSOX2があります。ネスチンは主に中枢神経系（CNS）の幹細胞で発現しますが、その発現はほぼすべての成熟したCNS細胞では見られないため、神経幹細胞の効率的なマーカーです。^[20]神経発生中Sox2は神経管の発達中の細胞全体と増殖中の中枢神経系前駆細胞に発現しており、神経幹細胞の増殖と分化に中心的な役割を果たすと考えられています。^[20]細胞内分子に加えて、ABCG2、FGF R4、Frizzled-9など、細胞表面に発現するタンパク質を研究するための製品も利用できます。

神経幹細胞の分化は、状況依存的に、マーカーとして使用できる正または負の調節因子として機能する内因性因子と細胞外シグナル伝達分子によって制御されます。^[21]

神経前駆細胞は、継続的な自己複製ができず、通常は1種類の分化子孫のみを生み出す能力を持つため、神経幹細胞とは異なります。これらは、ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイトを生み出すことができる多分化能細胞です。たとえば、オリゴデンドログリア前駆細胞は、有糸分裂能力が尽きるまでオリゴデンドロサイトを生み出します。^[17] 一部の神経前駆細胞マーカーは、ロゼットからニューロンへの拡大および分化の過程を追跡できます。神経ロゼットは、分化胚性幹細胞の培養における神経前駆細胞の発生シグネチャーです。ロゼットは、神経管の神経上皮細胞で発現するタンパク質の多くを発現する円柱細胞の放射状配列です。ロゼット内の細胞は、ネスチン、NCAM、増殖中の神経幹細胞で発現するRNA結合タンパク質であるMusashi-1など、複数の細胞マーカーを発現することが示されている。 ^[22] 神経上皮前駆細胞（NEP）は神経管での神経発生を担っており、放射状グリアと基底前駆細胞という2種類の神経前駆細胞も生じます。放射状グリアは発達中の脳で優勢な前駆細胞タイプであるのに対し、基底前駆細胞は発達中の終脳の脳室下帯（SVZ）に特異的に位置しています。放射状グリアの機能研究は増えていますが、神経前駆細胞やアストロサイトと区別することは困難です。神経前駆細胞と同様に、放射状グリアは中間径フィラメントタンパク質ネスチンと、神経管の腹側半分の一部の神経前駆細胞で発現している転写因子PAX6を発現しています。放射状グリア細胞は、広く使用されているグリア線維性酸性タンパク質（GFAP）など、アストロサイトに特徴的なタンパク質も発現しています。放射状グリア細胞に特有である可能性のある細胞学的マーカーには、マウス抗原を認識するRC1抗体とRC2抗体によって識別されるネスチンの改変型が含まれます。^[23]

マーカーは、ニューロンに存在する核、細胞質、膜、シナプス周囲の産物から、さまざまな発達段階のニューロンを検出できます。また、コリン作動性、ドーパミン作動性、セロトニン作動性、GABA作動性、グルタミン酸作動性ニューロンを特異的に標識することも可能です。^[24]汎ニューロンマーカーには複数のターゲット（体細胞、核、樹状突起、スパイン、軸索タンパク質）があり、その結果、ニューロンのすべての部分を標識します。ニューロンの特定の領域を標識する特定のマーカーもありますが、これはニューロンの形態を研究するために使用されます。^[25]

ダブルコルチン（DCX）は微小管関連タンパク質であり、移動中のニューロンの細胞体と誘導突起、および分化ニューロンの軸索に広く発現している。その発現は成熟とともに低下する^[26]

ニューロン特異的クラスIII β-チューブリン（TuJ1）は、新しく生成された未熟な有糸分裂後ニューロンと分化したニューロン、およびいくつかの有糸分裂活性ニューロン前駆細胞に存在する。^[11]

微小管関連タンパク質2（MAP-2）は細胞骨格タンパク質です。その発現はニューロン前駆細胞では弱いですが、ニューロンの発達過程で増加します。一般的に、その発現はニューロンと反応性アストロサイトに限定されています。^[15]

ニューロン特異エノラーゼ（NSE）はガンマエノラーゼまたはエノラーゼ2とも呼ばれ、成熟ニューロンで発現する細胞質タンパク質です。NSEレベルはニューロンの発達とともに増加し、後期にはより高いレベルに達します。オリゴデンドロサイト分化中のグリア細胞では、ニューロン培養で見られるレベルと同じレベルで発現しますが、細胞が成熟すると抑制されます。病理学的状態では、グリア腫瘍および反応性グリア細胞がこのマーカーを発現することも報告されています。^[15]

カルレチニンは脊椎動物の網膜のさまざまな神経細胞集団に広く分布しており、未熟な有糸分裂後の神経細胞の貴重なマーカーとなっている。^[11]

神経核抗原（NeuN）またはFox-3は、成熟細胞への分化の段階にある有糸分裂後の細胞に存在する核タンパク質です。^{[27]プルキンエ細胞、嗅球僧帽細胞、網膜光受容体、}黒質のドーパミン作動性ニューロンを除くほぼすべての神経細胞タイプを検出するために使用できます。^[15]

カルビンジンは小脳プルキンエ細胞と海馬顆粒細胞で発現している。^[11]ラットの小脳におけるカルビンジン染色プルキンエ細胞が末梢神経損傷後に再編成および移動したことから、カルビンジンはカルレチニンと同様に未熟な有糸分裂後ニューロンのマーカーである可能性が示唆されている。^[28]

チロシン水酸化酵素（TH）はドーパミンとノルエピネフリンの合成に関与する酵素である。一般的にはドーパミン作動性ニューロンのマーカーとして使用されるが、ノルエピネフリン（ドーパミンと酵素ドーパミンβ-水酸化酵素の産物）を作る一部の前脳ニューロンにも存在する。 ^[29]

コリンアセチルトランスフェラーゼ（ChAT）は、中枢神経系と末梢神経系の両方のコリン作動性ニューロンで発現しています。中枢神経系では、ChATは脊髄の運動ニューロンと節前自律神経ニューロン、新線条体と前脳基底部のニューロンのサブセットで発現しています。一方、末梢神経系では、交感神経ニューロンの小グループとすべての副交感神経ニューロンに存在します。^[30]

GABAはGABA作動性介在ニューロン（一般的に脳内の介在ニューロンである抑制ニューロン）で発現する成熟したニューロンマーカーである。GAD65/67はGABA作動性介在ニューロンによるGABA合成に関与する2つの酵素である。^[29]

アルツハイマー病の中心タンパク質であるアミロイド前駆体タンパク質（APP）は、ニューロンの分化中に異なる形で発現します。APPアイソフォーム695と714の発現は、よく分化した有糸分裂後のニューロン細胞でアップレギュレーションされ、APPアイソフォーム770はダウンレギュレーションされます。これらのダイナミクスは、ニューロンの分化状態に関する貴重な洞察を提供し、ニューロンの発達と成熟段階の特定と研究に役立ちます。^[31]

ニューロン系譜マーカーは、臨床研究において、病変細胞や修復過程を特定するために使用できます。機能ニューロンの選択的変性は、パーキンソン病における中脳ドーパミン作動性ニューロン、アルツハイマー病における前脳コリン作動性ニューロン、統合失調症における皮質GABA作動性ニューロンの変性など、神経変性疾患の発症に関連しているため、ニューロン細胞の表現型のマーカーは、臨床疾患の病理を理解する上で有用であるため、特に興味深いものです。^{[32]これらの研究には、}コリンアセチルトランスフェラーゼとチロシン水酸化酵素という2つの重要なマーカーがあります。コリンアセチルトランスフェラーゼ（ChAT）は、アセチルコリンの合成を触媒する酵素であり、ほとんどのコリン作動性ニューロンで発現しています。したがって、ChAT免疫反応性は、いくつかの神経変性疾患における認知機能低下を検出するために使用されます。^[15] 運動野、感覚皮質、および基底前脳では、これらの免疫標識は、ChAT繊維ネットワークのコリン作動性ニューロンの破壊や全体的な形態を評価するために適用されています。^[33] チロシン水酸化酵素（TH）免疫標識は、パーキンソン病の研究に非常に有用です。パーキンソン病患者のドーパミン作動性細胞の損失量を決定するために使用されます。