インサイチューハイブリダイゼーション

インサイチューハイブリダイゼーション（ISH）は、標識された相補的 DNA、 RNAまたは修飾核酸鎖（すなわち、プローブ）を使用して、組織の一部または切片（インサイチュー）または組織が十分に小さい場合（植物の種子、ショウジョウバエの胚など）、組織全体（ホールマウントISH）、細胞、および循環腫瘍細胞（CTC）内の特定の DNA または RNA 配列の位置を特定するハイブリダイゼーションの一種です。これは、通常、組織切片内のタンパク質の位置を特定する免疫組織化学とは異なります。

インサイチューハイブリダイゼーションは、染色体上または組織内の特定の核酸配列の位置を明らかにするために使用され、遺伝子の構成、制御、および機能を理解するための重要なステップです。現在使用されている主要な技術には、オリゴヌクレオチドおよびRNAプローブ（放射標識およびハプテン標識の両方）を使用したmRNAへのインサイチューハイブリダイゼーション、光学顕微鏡および電子顕微鏡による分析、全マウントインサイチューハイブリダイゼーション、RNAおよびRNAとタンパク質の二重検​​出、および染色体配列を検出するための蛍光インサイチューハイブリダイゼーションがあります。DNA ISHは、染色体の構造を決定するために使用できます。たとえば、蛍光DNA ISH （FISH）は、医療診断で染色体の完全性を評価するために使用できます。RNA ISH（RNAインサイチューハイブリダイゼーション）は、組織切片、細胞、全マウント、および循環腫瘍細胞（CTC）内のRNA（mRNA、lncRNA、およびmiRNA）を測定し、位置を特定するために使用されます。インサイチューハイブリダイゼーションはアメリカの生物学者メアリー・ルー・パーデューとジョセフ・G・ガルによって発明されました。^{[1] [2] [3]}

インサイチューハイブリダイゼーションは、組織切片中の個々の細胞内の特定のmRNA種を同定するための強力な技術であり、生理学的プロセスや疾患の発症機序に関する洞察を提供します。しかし、インサイチューハイブリダイゼーションでは、検査する組織や使用するプローブごとに正確に最適化された多くの手順を実行する必要があります。組織内の標的mRNAを保存するために、架橋固定剤（ホルムアルデヒドなど）を使用する必要があることがよくあります。^[4]

さらに、組織切片の in situ ハイブリダイゼーションでは、組織切片が非常に薄く、通常は 3 μm から 7 μm の厚さである必要があります。in situ ハイブリダイゼーション処理用に組織切片を準備する一般的な方法には、クライオスタットまたはCompresstome 組織スライサーで標本を切断することが含まれます。クライオスタットは、新鮮な組織または固定された組織を採取し、液体窒素に浸して急速冷凍します。次に、組織を OCT と呼ばれる凍結媒体に包埋し、薄切片を切断します。障害には、組織に凍結アーティファクトが発生し、適切な mRNA 染色を妨げる可能性があることが含まれます。Compresstomeは、凍結プロセスなしで組織を薄切片に切断します。浮遊切片は、安定性のためにアガロースに包埋した後に切断されます。この方法により、組織の凍結とそれに伴う凍結アーティファクトを回避できます。このプロセスは、完了すると永久的かつ不可逆的です。^[5]

ハイブリダイゼーション組織化学では、サンプル細胞および組織は通常、標的転写産物を所定の位置に固定し、プローブのアクセスを向上させるために処理されます。前述のように、プローブは標識された相補的 DNAか、現在最も一般的には相補的RNA (リボプローブ) のいずれかです。プローブは高温で標的配列にハイブリダイズし、その後余分なプローブが洗い流されます (ハイブリダイズしていない余分な RNA プローブの場合は、RNase を使用して事前に加水分解した後)。温度、塩、および/または洗剤濃度などの溶液パラメータを操作して、非同一相互作用を除去することができます (つまり、完全に一致する配列のみが結合したままになります)。次に、放射性、蛍光または抗原標識塩基 (例:ジゴキシゲニン) で標識されたプローブを、それぞれオートラジオグラフィー、蛍光顕微鏡、または免疫組織化学を使用して組織内で局在化し、定量化します。 ISH は、放射能またはその他の非放射性ラベルで標識された 2 つ以上のプローブを使用して、2 つ以上の転写産物を同時に検出することもできます。

代替技術である分岐 DNA アッセイは、放射能を使用せずに単一分子の感度で RNA (mRNA、lncRNA、および miRNA) in situハイブリダイゼーション アッセイに使用できます。このアプローチ (例: ViewRNA アッセイ) を使用すると、1 つのアッセイで最大 4 つのターゲットを視覚化でき、特許取得済みのプローブ設計と bDNA シグナル増幅を使用して、感度と特異性に優れたシグナルを生成します。サンプル (細胞、組織、CTC) を固定し、RNA ターゲットにアクセスできるように処理します (RNA アンマスキング)。ターゲット固有のプローブは、各ターゲット RNA にハイブリダイズします。その後のシグナル増幅は、隣接するプローブ (RNA ターゲットに並んで結合する個々のオリゴヌクレオチド[オリゴ]) の特定のハイブリダイゼーションを前提としています。一般的なターゲット固有のプローブには 40 個のオリゴヌクレオチドが含まれ、mRNA と lncRNA の検出では 20 個のオリゴペアがターゲットに並んで結合し、miRNA の検出では 2 個のオリゴまたは 1 組のオリゴが生成されます。シグナル増幅は、一連の連続ハイブリダイゼーション手順によって実現されます。プレアンプ分子がターゲット特異的 RNA 上の各オリゴペアにハイブリダイズし、次に複数のアンプ分子が各プレアンプにハイブリダイズします。次に、複数のラベルプローブオリゴヌクレオチド (アルカリホスファターゼに結合、または直接蛍光体に結合されている) が各アンプ分子にハイブリダイズします。完全に組み立てられたシグナル増幅構造「ツリー」には、ラベルプローブ用の結合部位が 400 個あります。すべてのターゲット特異的プローブがターゲット mRNA 転写物に結合すると、その転写物 1 つに対して 8,000 倍のシグナル増幅が起こります。別々でありながら互換性のあるシグナル増幅システムにより、マルチプレックスアッセイが可能になります。シグナルは、蛍光顕微鏡または明視野顕微鏡を使用して視覚化できます。

1. プロテアーゼ Kによる細胞膜の透過処理（約 25 分、組織切片や初期段階の胚には必要ありません）
2. mRNA と標識 RNA プローブの結合 (通常は一晩)
3. 抗体ホスファターゼがRNAプローブに結合する（数時間）
4. 抗体の染色（例：アルカリホスファターゼによる）

プロトコルには約2〜3日かかり、セットアップにも時間がかかります。プロセスを自動化するロボットを販売している企業もあります（例：CEM InsituPro）。その結果、研究室では数千の遺伝子を対象に大規模なスクリーニングが実施されています。結果は通常、ウェブサイト（外部リンクを参照）からアクセスできます。^[6]

• クロモジェニックin situハイブリダイゼーション（CISH）
• 蛍光in situハイブリダイゼーション
• mRNAに基づく疾患診断

1. Jin, L; Lloyd, RV (1997). 「In situ ハイブリダイゼーション: 方法と応用」。Journal of Clinical Laboratory Analysis . 11 (1): 2–9. doi :10.1002/(SICI)1098-2825(1997)11:1<2::AID-JCLA2>3.0.CO;2-F. PMC 6760707.  PMID 9021518  .
2. 包括的かつ注釈付きのin situハイブリダイゼーション組織化学
3. 膵臓循環腫瘍細胞のRNA配列解析により、転移におけるWNTシグナル伝達が示唆される
4. ディープシーケンシングと高解像度イメージングによって明らかにされたシナプス神経網の局所トランスクリプトーム

• 米国国立医学図書館医学件名標目表(MeSH)における In-Situ-Hybridization
• 細胞、CTC、組織へのRNAおよびmiRNAプローブのin situハイブリダイゼーション
• 植物組織へのRNAプローブの全載in situハイブリダイゼーション
• 最大6つの異なる蛍光色素を使用した3D FISH用の複雑なDNAプローブセットの調製
• RNAi処理したショウジョウバエの表現型解析のための全載胚の転写in situハイブリダイゼーション
• 現場データベース:
  • ゴースト、C. intestinalis 転写因子
  • ゼブラフィッシュの遺伝子発現
  • マウスMGI GXD遺伝子発現
  • eurexpress 2019-03-13にWayback Machineでアーカイブされました