N-アシルホスファチジルエタノールアミン特異的ホスホリパーゼD

N-アシルホスファチジルエタノールアミンホスホリパーゼD（NAPE-PLD）は、N-アシルホスファチジルエタノールアミン（NAPE）からN-アシルエタノールアミン（NAE）の遊離を触媒する酵素です。これは、通常の脂質をアナンダミドやオレオイルエタノールアミンなどの化学シグナルに変換するプロセスの主要部分です。ヒトでは、NAPE-PLDタンパク質はNAPEPLD遺伝子によってコードされています。^{[1] [2] [3] [4]}

NAPE-PLD は、細胞膜にあるリン脂質に作用する酵素活性（ホスホリパーゼ）です。ホスホリパーゼ Dとして分類されるのは、相同性ではなく、その活性の化学的結果によるものです。この酵素活性は、一連の実験で発見され、特徴付けられ、2004 年にペプチド配列決定を行うことができる生化学的精製スキームが発表されました。 ^[2] 研究者らは、150 匹のラットの心臓をホモジェナイズ（細かく粉砕）し、得られた粗溶解物を105,000 xg でショ糖沈殿にかけ、細胞膜を細胞の残りの部分から分離しました。次に、膜貫通タンパク質をオクチルグルコシドを使用して可溶化し、4 つのカラムクロマトグラフィーステップ（HiTrap SP HP 陽イオン交換カラム、HiTrap Q 陰イオン交換カラム、HiTrap Blue アフィニティ カラム、Bio-Gel HTP ハイドロキシアパタイト カラム）にかけました。これらはそれぞれ、タンパク質が時間の経過とともにカラムから溶出される際に、異なるタイプの膜タンパク質を異なるサンプル容器に分離し、各容器内のサンプルの活性を測定することで、活性酵素を受け取ったサンプルを追跡することができました。酵素活性の測定は、NAPE-PLD 酵素活性に敏感な放射性基質の薄層クロマトグラフィーによって行われました。基質の切断は、バイオイメージング分析装置で放射線が検出されたときに、プレート上の基質の出現場所に影響を与えました。

この広範囲にわたる手順の結果はまだ純粋なタンパク質ではありませんでしたが、SDS-PAGEで限られた数のバンドが生成され、46キロダルトンのバンド1つが酵素活性と強度的に相関していることがわかりました。このバンドをゲルから切り取ってトリプシンで消化し、逆相高速液体クロマトグラフィーでペプチドを分離しました。得られた断片は、次に自動エドマン分解法でマイクロシーケンスしました。^[5] 3つは、汚染物質であると考えられていた56kDaの中間径フィラメントタンパク質であるビメンチンに対応し、他の2つはその後NAPE-PLDとして特定されたcDNAクローンと一致しました。

この手がかりが得られれば、より手間のかからない手順で同定を確認することができます。COS -7細胞で推定NAPE-PLD cDNAを過剰発現させると、強力なNAPE-PLD酵素活性が得られ、その特性は元の心臓抽出物の特性と類似していることが示されました。^[2]

NAPEPLD cDNA配列は、マウスとラットの両方で396個のアミノ酸配列を予測し、これらはヒトのものと89%と90%同一です。^{[2] NAPE-PLDは既知の}ホスホリパーゼD遺伝子 と相同性がないことがわかりましたが、相同性によってβ-ラクタマーゼフォールドの亜鉛メタロヒドロラーゼファミリーに分類できます。特に、高度に保存されたモチーフH X( E / H )X D ( C / R / S / H )X _50–70 H X _15–30 ( C / S / D )X _30–70 Hが観察されました。これは通常、このクラスのタンパク質の亜鉛結合および加水分解反応に関連しており、著者らは活性が亜鉛含有量と相関しているはずだと提案しています。

組み換えNAPE-PLDをCOS細胞で試験管内試験したところ、いくつかの放射性標識基質に対して同様の活性を示した。N-パルミトイルホスファチジルエタノールアミン、N-アラキドノイルホスファチジルエタノールアミン、N-オレオイルホスファチジルエタノールアミン、およびN-ステアロイルホスファチジルエタノールアミンはすべて、Lineweaver–Burkプロットで計算したところ、 2～4マイクロモルのK _mと73～101ナノモル/ミリグラム/分のV _maxで反応した。^[2] （これらはそれぞれ、N-パルミトイルエタノールアミン、アナンダミド、N-オレオイルエタノールアミン、およびN-ステアロイルエタノールアミンを生成する）この酵素は、N-パルミトイル-リゾ-ホスファチジルエタノールアミンおよびN-アラキドノイル-リゾ-ホスファチジルエタノールアミンとも同様のK _mで反応したが、V _maxの3分の1～4分の1であった。これらの活性は、多くの組織がさまざまなN -アシルエタノールアミンを生成するという観察と一致しています。

しかし、NAPE-PLD は、他のホスホリパーゼ D酵素によって触媒されるように、ホスファチジルコリンまたはホスファチジルエタノールアミンから検出可能なホスファチジン酸を生成する能力がありませんでした。また、エタノールまたはブタノールの存在下でホスファチジン酸ではなくホスファチジルアルコールの生成を可能にするホスホリパーゼ D のトランスホスファチジル化活性も欠いています。

この酵素は、グリセロリン脂質のsn -1 位からホスファチジルエタノールアミンのアミノ基へのアシル基の転移によるN-アシルホスファチジルエタノールアミンの生成によって開始される生化学的経路の 2 番目のステップとして機能します。^{[2] NAPE-PLD は哺乳類の}中枢神経系でいくつかの NAE の生合成に寄与していますが、 NAPE-PLDノックアウトマウスではアナンダミドが野生型レベルか非常に減少していることが報告されているため、この酵素がエンドカンナビノイドのアナンダミドの形成に関与していないかどうかは明らかではありません。^[6]

この酵素によって放出されるN-アシルエタノールアミンは、エタノールアミンから遊離脂肪酸を加水分解する脂肪酸アミド加水分解酵素（FAAH）の潜在的な基質となる。この酵素の欠陥により、アナンダミドなどのNAPE-PLD産物が通常観察されるレベルより15倍も高くなる可能性がある。^[7]

この膜酵素はホモ二量体を形成し、部分的に内部の約 9 Å 幅のチャネルによって分離されています。^[8]メタロβ-ラクタマーゼタンパク質フォールドは、膜リン脂質と結合するように適応しています。疎水性キャビティは、基質NAPE が活性部位に進入する ための入り口となり、そこで二核亜鉛中心が加水分解を触媒します。胆汁酸はこのキャビティ内の選択的ポケットに高い親和性で結合し、二量体組み立てを促進して触媒作用を可能にします。NAPE-PLD は、胆汁酸シグナルと脂質アミドシグナル間のクロストークを促進します。 ^{[8] [9] [10]}