差次遠心分離

生化学および細胞生物学において、分画遠心分離法（分画速度遠心分離法とも呼ばれる）は、沈降速度に基づいて細胞小器官やその他の細胞内粒子を分離するために使用される一般的な手順である。生物学的分析でよく適用される分画遠心分離法は、非生物の懸濁粒子（ナノ粒子、コロイド粒子、ウイルスなど）の粗精製にも適した一般的な技術である。分画遠心分離法が細胞生物学的現象（細胞小器官の分布など）の分析に使用される典型的なケースでは、まず組織サンプルを溶解して細胞膜を破壊し、細胞小器官と細胞質を放出する。次に、溶解液を繰り返し遠心分離にかけ、所定の遠心力で所定の時間十分に速く沈降する粒子が遠心管の底にコンパクトな「ペレット」を形成する。^[1]

各遠心分離後、上清（ペレット化されていない溶液）をチューブから除去し、遠心力および/または時間を増加させて再度遠心分離する。分画遠心分離は沈降速度に基づく粗分離に適しているが、平衡密度勾配遠心分離により密度に基づくより細かい粒子の精製を行うことができる。^[2]このように、分画遠心分離法は、より高い遠心力を使用して、前の上清から粒子を連続的にペレット化する。^[3]分画遠心分離によって分離された細胞小器官は、分離中に変性条件にさらされない限り、比較的高い程度の正常機能を維持する。^[4]^[5]

理論

粘性流体では、特定の懸濁粒子の沈降速度（粒子の密度が流体よりも高い場合）は、主に次の要因によって決まります。

重力
密度の違い
流体の粘度
粒子の大きさと形状

粒子が大きいほど、より速く、より低い遠心力で沈降します。粒子の密度が流体より低い場合 (例: 水中の脂肪)、粒子は沈降せず、粒子が受ける重力の強さに関係なく、むしろ浮きます。遠心力は、密度だけでなく、粒子のサイズと形状に基づいて成分を分離します。対照的に、より特殊な平衡密度勾配遠心分離は、粒子密度のみに依存する分離プロファイルを生成するため、より細かい粒度の分離に適しています。

重力加速度が大きいと、非常に小さな（ナノスケール）粒子であってもブラウン拡散よりもはるかに速く沈降する。遠心分離機を使用する場合は、回転中心からの距離による重力加速度の変化を考慮してストークスの法則を修正する必要がある。^[6]

D={\sqrt {\frac {18\eta \,\ln(R_{f}/R_{i})}{(\rho _{p}-\rho _{f})\omega ^{2}t}}}

どこ

Dは沈降すると予想される粒子の最小直径（m）
η（またはμ）は流体の動粘度（Pa.s）です。
R _{f は}最終的な回転半径（m）です。
R _iは回転の初期半径（m）
ρ _pは粒子の体積質量密度（kg/m ³）
ρ _fは流体の体積質量密度（kg/m ³）
ωは角速度（ラジアン/秒）
_{tはR i}からR _fまで沈降するのに必要な時間（秒）である。

手順

分画遠心分離は、無傷の粒子（例：生物細胞、微粒子、ナノ粒子）に使用することも、特定の粒子の構成要素を分離するために使用することもできます。^[7] 真核生物の細胞小器官を無傷の細胞から分離する例を使用すると、最初に細胞を溶解して均質化する必要があります（理想的には、ダウンス均質化などの穏やかな技術を使用します。より厳しい技術や過剰な均質化では、無傷の細胞小器官の割合が低下します）。粗製の細胞小器官抽出物が得られたら、さまざまな遠心分離速度にかけ、細胞小器官を分離します。

超遠心分離

溶解したサンプルは、超遠心分離機で遠心分離する準備が整いました。超遠心分離機は、高速回転が可能な電気モーターで駆動されるローターを含む冷却された低圧チャンバーで構成されています。サンプルは、ローター内のチューブまたはローターに取り付けられたチューブに入れられます。回転速度は、床置き型では最大100,000 rpm、ベンチトップ型（Beckman Optima Max-XP、Sorvall MTX150、himac CS150NX）では150,000 rpmに達し、800,000gから1,000,000gの遠心速度力を生み出します。この力により、高分子が沈降し、小分子の不均一な分布を引き起こすこともあります。^[8]

細胞の断片はそれぞれ大きさや密度が異なるため、各断片はそれぞれ異なる最小遠心力でペレットに沈殿します。したがって、サンプルを異なる層に分離するには、まず元の溶解物を弱い力で遠心分離し、ペレットを取り除き、その後、上澄み液を順次より大きな遠心力にさらします。そのたびに、異なる密度の部分が容器の底に沈殿して抽出され、これを繰り返し適用すると、元のサンプルの異なる部分を含む一連の層が生成されます。得られた各ペレットをさらに精製するために、追加の手順を実行することができます。

沈降は、高分子の質量、形状、部分比容積、溶媒密度、ローターサイズ、回転速度に依存します。実験中に沈降速度をモニターして分子量を計算することができます。沈降係数（S）の値を計算できます。Sの値が大きい（沈降速度が速い）ほど、分子量が大きくなります。密度の高い粒子はより速く沈降します。細長いタンパク質は摩擦係数が大きく、精度を確保するために沈降が遅くなります。 ^[9]

差次遠心分離と密度勾配遠心分離の違い

示差遠心分離法と密度勾配遠心分離法の違いは、密度勾配遠心分離法では、サンプルが通過する異なる密度の溶液（スクロース、フィコール、パーコールなど）またはゲルを使用することです。これは、分子が遠心力によって沈殿し、自分と同じ密度の媒体に到達するという原理に基づいて、サンプルを相対密度によって層に分離します。^[10]分離の程度または層の数は、溶液またはゲルによって異なります。一方、示差遠心分離法では密度勾配を利用せず、遠心分離は速度を上げながら行われます。異なる遠心分離速度では、2つ以下の画分に分離されることが多いため、上清は追加の遠心分離ステップでさらに分離できます。そのためには、各ステップで遠心分離速度を上げ、目的の粒子が分離されるようにする必要があります。対照的に、密度勾配遠心分離法は通常、1つの遠心分離速度で実行されます。^[11]

参照

超遠心分離に関する図書館リソース

ライブラリ内のリソース
他の図書館のリソース

参考文献

^ Ohlendieck, Kay; Harding, Stephen E. (2018年4月19日). 「遠心分離と超遠心分離」. Wilson and Walker's Principles and Techniques of Biochemistry and Molecular Biology : 424–453. doi :10.1017/9781316677056.014. ISBN 9781107162273。
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[6] ハーディング、スティーブン E.、スコット、デビッド、ロウ、アーサー（2007 年 12 月 16 日）。分析用超遠心分離法：技術と方法。王立化学協会。ISBN 978-1-84755-261-7。

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