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MNase-seq（ micrococcal nuclease digestion with deep sequencingの略）[1][2][3][4]は、2006年にC. elegansゲノムのヌクレオソーム占有率を測定するために初めて開発された分子生物学的手法であり[ 1 ]、その後2008年にヒトゲノムに適用されました[ 2]。ただし、「MNase-seq」という用語は、その1年後の2009年まで造語されていませんでした[3 ]。簡単に言うと、この手法は、細菌Staphylococcus aureus由来の酵素である非特異的エンドエキソヌクレアーゼであるミクロコッカスヌクレアーゼを使用して、クロマチン上のタンパク質非結合DNA領域に結合して切断することに基づいています。ヒストンやその他のクロマチン結合タンパク質（転写因子など）に結合したDNAは消化されずに残る可能性がある。切断されていないDNAは、タンパク質から精製され、次世代シーケンシング法の1つ以上によって配列決定される。[ 5 ]
MNase-seq は、クロマチンアクセシビリティの解析を通じてエピゲノムの状態を評価するために使用される 4 つのクラスの方法の 1 つです。他の 3 つの技術は、 DNase-seq、FAIRE-seq、およびATAC-seqです。[ 4 ] MNase-seq は主にヒストンまたは他のクロマチン結合タンパク質によって結合された DNA 領域のシーケンスに使用されるのに対し、[ 2 ]他の 3 つの方法は、それぞれ、デオキシリボヌクレアーゼ I 高感受性部位 (DHS) のマッピング、[ 6 ]クロマチンタンパク質によって結合されていない DNA のシーケンス、[ 7 ]またはマーカーの転座による緩くパッケージ化されたクロマチン領域のシーケンスに一般的に使用されます。[ 8 ] [ 9 ] [ 4 ]
ミクロコッカスヌクレアーゼ（MNase）は、1956年に黄色ブドウ球菌（ S. aureus）で初めて発見され、 [ 10 ] 1966年にタンパク質が結晶化され、 [ 11 ] 1967年に特性が明らかにされました。 [ 12 ]クロマチンのMNase消化は、クロマチン構造の初期の研究において重要な役割を果たし、クロマチンの各ヌクレオソーム単位が約200bpのDNAで構成されていることを決定するために使用されました。 [ 13 ]これは、OlinsとOlinsの「ビーズ・オン・ア・ストリング」モデルとともに、[ 14 ]基本的なクロマチン構造に関するKornbergの考えを裏付けました。 [ 15 ]追加の研究により、MNaseはヒストンに結合した約140bpより短いDNAを分解できず、DNase IとIIは結合したDNAを10bpまで分解できることがわかりました。[ 16 ] [ 17 ]これにより最終的に、約 146 bp の DNA がヌクレオソーム コアに巻き付いていること、[ 18 ]約 50 bp のリンカー DNA が各ヌクレオソームを連結していること、[ 19 ]そして 10 個の連続した塩基対の DNA が間隔を置いてヌクレオソームのコアにしっかりと結合していることが明らかになった。[ 17 ]
クロマチン構造の研究に用いられることに加えて、ミクロコッカスヌクレアーゼ消化は、1967年に特性が明らかにされて以来、オリゴヌクレオチド配列決定実験にも用いられてきた。[ 20 ]また、MNase消化は、アデニンとチミンに富む領域を優先的に消化することで、酵母（Saccharomyces cerevisiae）ミトコンドリアDNA [ 21 ]やバクテリオファージDNA [ 22 ] [ 23 ]などのクロマチンフリー配列を解析する研究にも用いられてきた。 [ 24 ] 1980年代初頭には、MNase消化は、成熟SV40 [ 25 ]、ショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）[ 26 ]、酵母[ 27 ] 、サル[ 28 ]などの染色体のヌクレオソーム位相と関連DNAを決定するために用いられた。この消化法を用いてヒトの遺伝子発現に対するクロマチンアクセシビリティの関連性を研究した最初の研究は1985年に行われた。この研究では、ヌクレアーゼを用いて特定の癌遺伝子配列とクロマチンおよび核タンパク質との関連性が調べられた。[ 29 ]配列決定やアレイ情報を用いずにヌクレオソームの位置を決定するためにMNase消化法を用いた研究は2000年代初頭まで続いた。[ 30 ]
1990年代後半から2000年代初頭にかけて全ゲノムシーケンスが実現したことで、精製したDNA配列をS. cerevisiae [ 31 ] 、 Caenorhabditis elegans [ 32 ]、D. melanogaster [ 33 ] 、 Arabidopsis thaliana [ 34 ]、Mus musculus [ 35 ]、Homo sapiens [ 36 ]の真核生物ゲノムと比較することが可能になった。MNase消化は、S. cerevisiaeのゲノムワイドなヌクレオソーム占有率の研究に初めて適用され[ 37 ] 、マイクロアレイによる解析によって、どのDNA領域にMNase耐性ヌクレオソームが豊富に存在するかが決定された。 MNaseベースのマイクロアレイ解析は、酵母のゲノム全体規模[ 38 ] [ 39 ]やヒトの限られたゲノム領域[ 40 ] [ 41 ]でヌクレオソームの位置を決定するためによく利用され、転写不活性化の推論に利用される可能性がある。
2006年、次世代シーケンシングが初めてMNase消化と組み合わされ、C. elegansのヌクレオソーム配置とDNA配列の好みが調べられました。[ 1 ] これは、あらゆる生物におけるMNase-seqの最初の例でした。
2008年頃、次世代シーケンシングがより広く利用可能になり始めた頃になって初めて、MNase消化がハイスループットシーケンシング、すなわちSolexa/Illuminaシーケンシングと組み合わされ、ヒトのゲノムワイドスケールでヌクレオソームの位置を研究するようになった。[ 2 ] 1年後、ミクロコッカスヌクレアーゼ消化とクロマチン免疫沈降を意味する「MNase-Seq」と「MNase-ChIP」という用語がようやく作られた。[ 3 ] 2006年の最初の応用以来、[ 1 ] MNase-seqは真核生物全体でヌクレオソーム占有とエピゲノミクスに関連するDNAのディープシーケンシングに利用されてきた。[ 5 ] 2020年2月現在、MNase-seqはクロマチンのアクセシビリティのアッセイにまだ適用されている。[ 42 ]
クロマチンは動的であり、DNA上のヌクレオソームの位置は、さまざまな転写因子やリモデリング複合体の活性によって変化し、これらの部位での転写活性をほぼ反映します。ヌクレオソームに巻き付いたDNAは、一般的に転写因子がアクセスできません。[ 43 ]したがって、MNase-seqは、どの領域がヌクレオソームに結合しているかを直接決定することにより、DNAのどの領域が転写的にアクセスできないかを間接的に決定するために使用できます。[ 5 ]
典型的な MNase-seq 実験では、まず目的の組織から真核細胞の核を分離します。次に、MNase-seq はエンドエキソヌクレアーゼであるミクロコッカスヌクレアーゼを使用して、真核生物クロマチンのタンパク質非結合領域の DNA に結合して切断し、まず一方の鎖を切断して切除し、次に逆平行鎖も切断します。 [ 3 ]クロマチンは、必要に応じてホルムアルデヒドで架橋することができます。[ 44 ] MNase は補因子としてCa2 + を必要とし、通常最終濃度は 1mM です。[ 5 ] [ 12 ] DNA 領域がヌクレオソームコア (つまりヒストン) または他のクロマチン結合タンパク質 (たとえば転写因子) によって結合されている場合、MNase は DNA に結合して切断することができません。ヌクレオソームまたはDNA-タンパク質複合体はサンプルから精製でき、結合したDNAはゲル電気泳動と抽出によってその後精製できます。精製されたDNAは通常、ヌクレオソームから精製された場合は約150bpですが[ 2 ]、他のタンパク質（転写因子など）から精製された場合はそれよりも短くなります[ 45 ] 。このため、ショートリードのハイスループットシーケンスはMNase-seqに最適です。これらの技術のリードは非常に正確ですが、長さは数百の連続した塩基対しかカバーできません[ 46 ] 。シーケンスされたリードは、Bowtieなどのツールを使用して参照ゲノムにアラインメントして、どのDNA領域がヌクレオソームまたは目的のタンパク質によって結合されているかを決定できます[ 4 ]。MNase -seqによって解明されたヌクレオソームの位置は、消化時のゲノム発現[ 47 ]と調節[ 48 ]を予測するために使用できます。
最近では、MNase-seq は、 DNA 上の転写因子の結合場所を決定するためにも使用されています。 [ 49 ] [ 50 ]従来のChIP-seq は、解像度の品質、実験プロトコルの厳密性、およびDNA 断片化の問題を示しています。[ 50 ]従来の ChIP-seq は通常、超音波処理を使用してクロマチンを断片化しますが、クロマチン領域が互いに凝縮して強く結合しているため、ヘテロクロマチン領域に偏りが生じます。 [ 50 ]ヒストンとは異なり、転写因子は一時的に DNA にのみ結合します。ChIP-seq の超音波処理など、高温と界面活性剤の使用を必要とする他の方法では、因子の損失につながる可能性があります。CUT &RUN シーケンスは、MNase ベースの免疫沈降の新しい形式です。簡単に言うと、抗体でタグ付けされたMNaseを使用して、その抗体によって認識されるエピトープを提示する DNA 結合タンパク質に特異的に結合します。消化は転写因子周辺の領域で特異的に起こり、この複合体が核から拡散して、大きなバックグラウンドや超音波処理の複雑さを気にすることなく取得できます。この技術の使用には、高温や高濃度の界面活性剤は必要ありません。さらに、MNaseはエキソヌクレアーゼ活性とエンドヌクレアーゼ活性によりクロマチン消化を改善します。細胞はSDS / Triton X-100溶液で溶解されます。次に、MNase抗体複合体が添加されます。最後に、タンパク質-DNA複合体を分離し、その後DNAを精製して配列決定します。得られた可溶性抽出物には、50bp未満の断片が25倍濃縮されています。この濃縮の増加により、費用対効果の高い高解像度データが得られます。[ 50 ]
単一細胞ミクロコッカスヌクレアーゼシーケンス（scMNase-seq）は、単一細胞のみを入力として使用してヌクレオソームの位置を分析し、クロマチンアクセシビリティを推測するために使用される新しい技術です。 [ 51 ]まず、蛍光活性化セルソーティング（FACS）を使用して細胞を単一のアリコートにソーティングします。[ 51 ]次に、細胞を溶解し、ミクロコッカスヌクレアーゼで消化します。分離されたDNAはPCR増幅にかけられ、目的の配列が分離され、分析されます。[ 51 ]単一細胞アッセイでMNaseを使用すると、DNase I高感受性部位や転写因子結合部位などの領域の検出が増加します。 [ 51 ]
MNase-seq は、クロマチンアクセシビリティとそれに続く遺伝子発現への影響をより直接的に決定するための4 つの主要な方法 ( DNase-seq、MNase-seq、FAIRE-seq、およびATAC-seq ) の 1 つです。[ 52 ]これら 4 つの技術はすべて、ヒストン尾部の特定のマークが遺伝子の活性化または抑制を示すという推論に依存するChIP-seqとは対照的です。 [ 53 ] ChIP-seq は、ヌクレオソームの位置を直接評価するのではなく、ヒストン修飾酵素機能の評価に役立ちます。[ 4 ]
MNase-seqと同様に、[ 2 ] DNase-seqは、既存のDNAエンドヌクレアーゼ[ 6 ]と次世代シーケンシング技術を組み合わせてクロマチンアクセシビリティをアッセイするために開発されました。[ 54 ]両方の技術は、それぞれの生物におけるヌクレオソームの位置に関する情報を確認するために、いくつかの真核生物で使用されています[ 4 ]。また、両方とも、開いたDNAを消化してヌクレオソームから約140bpのDNAバンドを分離するという同じ原理に基づいています[ 2 ] [ 55 ]。転写因子情報を確認する場合は、より短いバンドになります。[ 45 ] [ 55 ]両方の技術は最近、シングルセルシーケンシング用に最適化されており、両方の技術の主な欠点の1つである、大量の細胞入力が必要であるという点が修正されています。[ 56 ] [ 51 ]
十分な濃度であれば、DNase I はヌクレオソームに結合した DNA を 10bp まで消化できますが、ミクロコッカスヌクレアーゼはできません。[ 17 ]さらに、DNase-seq は DHS の同定に使用されます。DHS は DNase 処理に対して過敏な DNA 領域であり、多くの場合、調節領域 (プロモーターやエンハンサーなど) を示しています。[ 57 ] MNase では同等の効果は見られません。この違いにより、DNase-seq は主に調節領域を直接同定するために使用され、MNase-seq は転写因子とヌクレオソーム占有率を同定して遺伝子発現への影響を間接的に推測するために使用されます。[ 4 ]
FAIRE-seq は DNase-seq よりも MNase-seq との違いが大きい。[ 4 ] FAIRE-seq は 2007 年に開発され[ 7 ]、3 年後に次世代シーケンシングと組み合わせて DHS の研究に使用された。[ 58 ] FAIRE-seq は、ホルムアルデヒドを使用して標的タンパク質を DNA と架橋し、その後超音波処理とフェノールクロロホルム抽出によって非架橋 DNA と架橋 DNA を分離する。非架橋 DNA をシーケンスして分析することで、開いたクロマチンを直接観察できる。[ 59 ]
MNase-seq は、FAIRE-seq ほど直接的にクロマチンアクセシビリティを測定するものではありません。しかし、FAIRE-seq とは異なり、必ずしもクロスリンクを必要としません[ 5 ]、また超音波処理にも依存しません[ 4 ]が、フェノールおよびクロロホルム抽出が必要になる場合があります[ 5 ]。FAIRE -seq の 2 つの大きな欠点は、他の 3 つのクラスと比較して、最低 100,000 個の細胞が必要であることと、クロスリンクに依存していることです[ 7 ]。クロスリンクは、DNA と一時的に相互作用する他のクロマチン結合タンパク質に結合する可能性があり、そのため、水相から回収および分析できる非クロスリンク DNA の量が制限されます。[ 52 ]したがって、FAIRE-seq から得られる全体的な解像度は、DNase-seq や MNase-seq [ 52 ]の解像度よりも比較的低い可能性があり、100,000 個の細胞が必要であることから[ 7 ] 、DNase-seq [ 56 ]やMNase-seq [ 51 ]のシングルセル相当の方がはるかに魅力的な代替手段となる。[ 4 ]
ATAC-seq は、最も最近開発されたクロマチンアクセシビリティアッセイのクラスです。[ 8 ] ATAC-seq は、ハイパーアクティブトランスポザーゼを使用して、シーケンス用プライマーに結合できる特定のアダプターを持つ転移マーカーをクロマチンのオープン領域に挿入します。その後、PCR を使用して挿入されたトランスポゾンに隣接する配列を増幅し、クロマチン構造のシフトを引き起こすことなくオープンクロマチン配列を決定できます。[ 8 ] [ 9 ] ATAC-seq は、凍結サンプルを含む他の真核生物の中でもヒトで有効であることが証明されています。[ 60 ] DNase-seq [ 56 ]および MNase-seq [ 51 ]と同様に、ATAC-seq のシングルセルバージョンも開発されています。[ 61 ]
ATAC-seq は、クロマチンアクセシビリティの評価において MNase-seq に比べていくつかの利点があります。 ATAC-seq は、ミクロコッカスヌクレアーゼの可変消化や、架橋、フェノールクロロホルム抽出に依存しません。[ 5 ] [ 9 ]一般的にクロマチン構造を維持するため、ATAC-seq の結果は、MNase-seq を介して間接的にではなく、クロマチンアクセシビリティを直接評価するために使用できます。 ATAC-seq は数時間以内に完了することもできますが、[ 9 ]他の 3 つの手法は通常、一晩のインキュベーション期間を必要とします。[ 5 ] [ 6 ] [ 7 ] MNase-seq と比較した場合の 2 つの主な欠点は、より高いシーケンスカバレッジが必要であることと、DNA がミトコンドリア DNA と核 DNA の両方に非特異的に挿入されることによるミトコンドリア汚染が蔓延していることです。[ 8 ] [ 9 ]これらの軽微な欠点にもかかわらず、代替手段よりもATAC-seqの使用がますます普及している。[ 4 ]