ChIPシーケンシング

ChIP シーケンシング（ ChIP-seqとも呼ばれる）は、タンパク質とDNAの相互作用を分析するために使用される手法です。ChIP-seq は、クロマチン免疫沈降法（ChIP）と超並列 DNA シーケンシングを組み合わせて、DNA 関連タンパク質の結合部位を特定します。これにより、任意の対象タンパク質のグローバル結合部位を正確にマッピングできます。以前は、ChIP-on-chip がこれらのタンパク質と DNA の関係を研究するために使用されていた最も一般的な手法でした。

ChIP-seq は主に、転写因子やその他のクロマチン関連タンパク質が表現型に影響を与えるメカニズムにどのように影響するかを判断するために使用されます。タンパク質が DNA と相互作用して遺伝子発現を制御する方法を判断することは、多くの生物学的プロセスや疾患状態を完全に理解するために不可欠です。このエピジェネティック情報は、遺伝子型および発現分析を補完します。ChIP-seq 技術は現在、主にハイブリダイゼーション アレイを必要とするChIP-chipの代替として見られています。アレイは固定数のプローブに制限されるため、ある程度のバイアスが生じます。対照的に、シーケンシングはバイアスが少ないと考えられていますが、さまざまなシーケンシング技術のシーケンシング バイアスはまだ完全には理解されていません。^[1]

転写因子や他のタンパク質と直接物理的に相互作用する特定の DNA 部位は、クロマチン免疫沈降によって単離できます。ChIP は、目的のタンパク質に結合したターゲット DNA 部位のライブラリを作成します。全ゲノム配列データベースと組み合わせて大規模並列配列解析を使用すると、タンパク質と DNA の相互作用パターン^{[2]や、エピジェネティックな}クロマチン修飾のパターンを解析できます。これは、転写因子、ポリメラーゼ、転写機構、構造タンパク質、タンパク質修飾、DNA 修飾など、ChIP 可能なタンパク質と修飾のセットに適用できます。^[3]特定の抗体に依存する代わりに、DNase-Seq ^[4]やFAIRE-Seq など、ゲノム内のすべてのヌクレオソームが枯渇またはヌクレオソームが破壊されたアクティブな調節領域のスーパーセットを見つけるためのさまざまな方法が開発されています。^{[5] [6]}

ChIP は、生きた細胞内で特定のタンパク質に結合した DNA 配列を選択的に濃縮する強力な方法です。しかし、濃縮された DNA 配列をすべて特定できる十分に堅牢な方法がないため、この方法の広範な使用は限られていました。ChIP ウェット ラボ プロトコルには、ChIP とハイブリダイゼーションが含まれます。ChIP プロトコル^[7]には基本的に 5 つの部分があり、ChIP の全体的なプロセスをよりよく理解するのに役立ちます。ChIP を実行するための最初のステップは、有用な量を得るためにホルムアルデヒドと大量の DNA を使用して架橋^[8]することです。架橋はタンパク質と DNA の間だけでなく、RNA と他のタンパク質の間でも行われます。2 番目のステップはクロマチン断片化のプロセスで、クロマチンを分解して、最終的に ChIP 分析用の高品質の DNA 片を取得します。これらの断片は、ゲノム マッピングで最良の結果を得るために、それぞれ500 塩基対未満になるように切断する必要があります^[9] 。 3番目のステップはクロマチン免疫沈降法と呼ばれ、^[7] ChIPの略称です。ChIPプロセスでは、目的のタンパク質に対する抗体を使用して特定の架橋DNAタンパク質複合体を強化し、その後インキュベーションと遠心分離を行って免疫沈降を得ます。免疫沈降ステップでは、非特異的結合部位の除去も可能です。4番目のステップはDNAの回収と精製であり、^[7] DNAとタンパク質間の架橋を逆転させて分離し、抽出によってDNAを洗浄します。5番目で最後のステップは、qPCR、ChIP-on-chip（ハイブリッドアレイ）、またはChIPシーケンシングのプロセスによるChIPプロトコルの分析ステップです。次に、目的のタンパク質に結合したDNAの小さな部分にオリゴヌクレオチドアダプターを追加して、大規模な並列シーケンシングを可能にします。分析を通じて、タンパク質が結合した遺伝子または領域ごとに配列を識別および解釈できます。^[7]

サイズ選択後、得られたChIP-DNA断片はすべてゲノムシーケンサーを使用して同時に配列決定されます。1回のシーケンシング実行でゲノム全体の関連性を高解像度でスキャンできるため、染色体上の特徴を正確に特定できます。対照的に、ChIPチップでは、解像度を低くするために大量のタイリングアレイが必要です。^[10]

このシーケンスステップでは、多くの新しいシーケンス方法が使用されています。シーケンスを分析する一部の技術では、アダプターを連結した ChIP DNA フラグメントを固体フローセル基板上でクラスター増幅して、それぞれ約 1000 クローン コピーのクラスターを作成できます。フローセル表面で結果として生じるテンプレート クラスターの高密度アレイは、ゲノム解析プログラムによってシーケンスされます。各テンプレート クラスターは、新しい蛍光標識可逆性ターミネーター ヌクレオチドを使用して、合成によるシーケンスが並行して行われます。テンプレートは、各読み取り中に塩基ごとにシーケンスされます。次に、データ収集および解析ソフトウェアがサンプル シーケンスを既知のゲノム シーケンスにアラインメントして、ChIP-DNA フラグメントを識別します。^{[引用が必要]}

ChIP-seq は高速な分析を提供しますが、得られた結果が信頼できるものであることを確認するために品質管理を実行する必要があります。

• 非冗長部分：複雑性の低い領域は情報価値がなく、参照ゲノムのマッピングを妨げる可能性があるため、削除する必要があります。^[11]
• ピーク内の断片：ピーク内に位置するリードとピーク外に位置するリードの比率。^[11]

この技術の感度は、シーケンシングの深さ（つまり、マッピングされた配列タグの数）、ゲノムのサイズ、およびターゲット因子の分布に依存します。シーケンシングの深さはコストと直接相関しています。大規模なゲノムに豊富に存在するバインダーを高感度でマッピングする必要がある場合、膨大な数の配列タグが必要になるため、コストが高くなります。これは、コストが感度と相関していない ChIP チップとは対照的です。^{[12] [13]}

マイクロアレイベースのChIP法とは異なり、ChIP-seqアッセイの精度は、所定のプローブの間隔によって制限されません。多数の短い読み取りを統合することにより、非常に正確な結合部位の局在が得られます。ChIP-chipと比較して、ChIP-seqデータを使用すると、実際のタンパク質結合部位から数十塩基対以内の結合部位を見つけることができます。結合部位のタグ密度は、タンパク質-DNA結合親和性の優れた指標であり、^[14]これにより、タンパク質の異なるDNA部位への結合親和性を定量化して比較することが容易になります。^[15]

STAT1 DNAの関連性： ChIP-seqは、細胞集団の分析に使用されるHeLa株のクローンであるHeLa S3細胞におけるSTAT1標的の研究に使用されました。 ^[16]次に、ChIP-seqのパフォーマンスを、代替のタンパク質-DNA相互作用法であるChIP-PCRとChIP-chipと比較しました。^[17]

プロモーターのヌクレオソーム構造： ChIP-seqを用いて、酵母遺伝子にはRNAポリメラーゼが転写を開始できる150bpの最小限のヌクレオソームフリープロモーター領域があることが判明した。^[18]

転写因子の保存： ChIP-seqを用いて、マウス胎児の前脳と心臓組織における転写因子の保存性を比較した。著者らは、転写エンハンサーの心臓機能性を同定し検証し、心臓の転写エンハンサーは、同じ発達段階では前脳の転写エンハンサーよりも保存性が低いことを明らかにした。^[19]

ゲノムワイド ChIP-seq:線虫C. elegansの ChIP シーケンシングにより、22 の転写因子のゲノムワイドな結合部位が探索されました。注釈が付けられた候補遺伝子の最大 20% が転写因子に割り当てられました。いくつかの転写因子は非コード RNA 領域に割り当てられ、発達や環境変数の影響を受ける可能性があります。一部の転写因子の機能も特定されました。一部の転写因子は、他の転写因子を制御する遺伝子を制御します。これらの遺伝子は他の因子によって制御されません。ほとんどの転写因子は、他の因子のターゲットと制御因子の両方として機能し、制御ネットワークを示しています。^[20]

制御ネットワークの推定：ヒストン修飾のChIP-seqシグナルは、RNAレベルと比較してプロモーターの転写因子モチーフとより相関していることが示された。^[21]そのため著者は、ヒストン修飾ChIP-seqを使用すると、発現に基づく他の方法と比較して、遺伝子制御ネットワークのより信頼性の高い推定が可能になると提案した。

ChIP-seq は ChIP-chip の代替手段を提供します。STAT1 実験 ChIP-seq データは、同じ種類の実験で ChIP-chip によって得られた結果と高い類似性があり、64% を超えるピークが共通のゲノム領域にあります。データはシーケンス リードであるため、リード マッピングに高品質のゲノム シーケンスが利用可能であり、ゲノムにマッピング プロセスを混乱させる反復コンテンツがない限り、ChIP-seq は迅速な分析パイプラインを提供します。ChIP-seq は結合部位シーケンスの変異を検出する可能性もあり、これはタンパク質結合と遺伝子調節で観察されるあらゆる変化を直接サポートする可能性があります。

多くのハイスループットシーケンス手法と同様に、ChIP-seq は極めて大規模なデータセットを生成するため、適切な計算分析方法が必要です。ChIP-seq のリードカウントデータから DNA 結合部位を予測するために、ピーク呼び出し方法が開発されました。最も人気のある方法の 1 つ^[要出典]は MACS で、これは ChIP-Seq タグのシフトサイズを経験的にモデル化し、それを使用して予測される結合部位の空間解像度を向上させます。^[22] MACS は高解像度のピークに最適化されていますが、もう 1 つの一般的なアルゴリズムである SICER は、より広いクロマチンドメインを検索するために、キロベースからメガベースにまたがるより広いピークを呼び出すようにプログラムされています。SICER は、遺伝子本体にまたがるヒストンマークに適しています。より厳密な数学的方法である BCP (ベイジアン変化点) は、より高速な計算速度でシャープなピークと広いピークの両方に使用できます。^{[23] Thomas}ら(2017)による ChIP-seq ピーク呼び出しツールのベンチマーク比較を参照してください。 ^[24]

もう一つの関連する計算上の問題は、異なる生物学的条件からの2つのChIP-seq信号の有意な差を識別する差分ピークコーリングである。差分ピークコーラーは、2つのChIP-seq信号をセグメント化し、隠れマルコフモデルを使用して差分ピークを識別する。2段階差分ピークコーラーの例としては、ChIPDiff ^[25]やODIN ^{[26]がある。}

ChIP-seqからの偽部位を減らすために、複数の実験コントロールを使用してIP実験から結合部位を検出することができます。Bay2Ctrlsはベイジアンモデルを採用し、IPのDNA入力コントロール、モックIP、および対応するDNA入力コントロールを統合して、IPからの結合部位を予測します。^[27]このアプローチは、モデル生物全体などの複雑なサンプルに特に効果的です。さらに、分析によると、複雑なサンプルの場合、モックIPコントロールはDNA入力コントロールよりも大幅に優れていることが示されています。これは、サンプルのアクティブなゲノムが原因であると考えられます。^[27]

• ChIPオンチップ
• PCR法
• チップPET
• 哺乳類プロモーターデータベース

• CUT&RUN シーケンシングは、ChIP の代わりにミクロコッカス ヌクレアーゼによる抗体標的制御切断で、シーケンシング中の信号対雑音比が向上します。
• CUT&Tag シーケンシングでは、ChIP の代わりにトランスポザーゼ Tn5 による抗体標的制御切断により、シーケンシング中の信号対雑音比が向上します。
• Sono-Seq は、ChIP-Seq と同じですが、免疫沈降ステップを省略します。
• HITS-CLIP ^{[28] [29]}（CLIP-Seqとも呼ばれる）は、DNAではなくRNAとの相互作用を見つけるためのものです。
• PAR-CLIP は、細胞の RNA 結合タンパク質 (RBP) の結合部位を識別する別の方法です。
• RIP-Chip、同じ目標と最初のステップですが、クロスリンク法を使用せず、シーケンシングの代わりにマイクロアレイを使用します。
• SELEX、コンセンサス結合配列を見つける方法
• DNA 上の相対的な置換ダイナミクスを測定するためのCompetition-ChIP。
• RNA に結合した DNA とタンパク質を測定するためのChiRP-Seq。
• ChIP-exoはエキソヌクレアーゼ処理を使用して、最大1塩基対の解像度を実現します。
• ChIP-nexus は、最大 1 塩基対の解像度を実現するようにChIP-exoを改良したバージョンです。
• DRIP-seq はS9.6 抗体を使用して、R ループと呼ばれる 3 本鎖 DND:RNA ハイブリッドを沈殿させます。
• TCP-seq は、mRNA の翻訳ダイナミクスを測定するための基本的に同様の方法です。
• Calling Cardsは、トランスポザーゼを使用して転写因子が結合する配列をマークします。^[30]

• ReMapカタログ：2800以上のChIP-seqデータセットからの調節要素の統合的かつ均一なChIP-Seq解析により、485の転写調節因子からの8000万ピークのカタログが提供されます。^[1]
• ChIPBase データベース: ChIP-Seqデータから転写因子結合マップを探索するためのデータベース。さまざまな細胞/組織タイプと条件に対して最も包括的な ChIP-Seq データ セットを提供します。
• GeneProf データベースおよび分析ツール: GeneProf は、ChIP-seq および RNA-seq データ用の、無料でアクセスでき、使いやすい分析環境であり、転写因子結合やヒストン修飾などの、すぐに分析できる公開実験の大規模なデータベースが付属しています。
• 差分ピーク呼び出しは、Wayback Machineで 2021 年 5 月 15 日にアーカイブされました: ODIN を使用した差分ピーク呼び出しのチュートリアル。
• ChIP-seqデータのバイオインフォマティクス解析：ChIP-seqデータの包括的な解析。^[2]
• KLTepigenome: Karhunen-Loeve 変換を使用してエピゲノム データセット内の相関変動を明らかにする。
• SignalSpider: 複数の正規化されたChIP-Seqシグナル プロファイルで確率的パターンを発見するツール
• FullSignalRanker: 複数の正規化されたChIP-Seq信号プロファイルの回帰とピーク予測のためのツール