単一細胞シーケンシング

シングルセルシーケンシングは、最適化された次世代シーケンシング技術を使用して個々の細胞からの核酸配列情報を調べ、細胞の違いをより高解像度で把握し、個々の細胞の機能をその微小環境のコンテキストでよりよく理解できるようにします。^[1]たとえば、がんの場合、個々の細胞の DNA をシーケンシングすると、小さな細胞集団が持つ変異に関する情報が得られます。発達においては、個々の細胞によって発現される RNA をシーケンシングすると、異なる細胞タイプの存在と動作に関する洞察が得られます。^[2]微生物システムでは、同じ種の集団が遺伝的にクローン化されているように見える場合があります。それでも、RNA またはエピジェネティックな変更のシングルセルシーケンシングにより、細胞間の変動性が明らかになり、変化する環境に集団が迅速に適応して生き残るのに役立つ可能性があります。^[3]

典型的なヒト細胞は、約 2 x 33 億塩基対の DNA と 6 億塩基の mRNA で構成されています。通常、サンガーシーケンスや次世代シーケンスなどの従来の方法を使用して DNA または RNA をシーケンスするには、数百万個の細胞の混合物が使用されます。単一細胞からの DNA と RNA のディープシーケンスにより、細胞機能を広範囲に調査できます。^[1]一般的な次世代シーケンス実験と同様に、単一細胞シーケンスプロトコルには通常、次の手順が含まれます。単一細胞の分離、核酸の抽出と増幅、シーケンスライブラリの準備、シーケンス、およびバイオインフォマティクスデータ分析。単一細胞シーケンスを実行することは、バルクの細胞からシーケンスを実行するよりも困難です。単一細胞からの開始材料の量が最小限であるため、劣化、サンプルの損失、および汚染がシーケンスデータの品質に顕著な影響を及ぼします。さらに、使用される核酸の数がピコグラムレベルであるため、^[4]単一細胞シーケンスのサンプル調製中に大量の増幅が必要になることが多く、その結果、カバレッジが不均一になり、ノイズが発生し、シーケンスデータの定量化が不正確になります。

最近の技術の進歩により、単一細胞シーケンシングは、一見アクセス不可能と思われる一連の問題に取り組むための有望なツールとなっています。たとえば、異種サンプル、希少細胞タイプ、細胞系統関係、体細胞のモザイク、培養できない微生物の分析、疾患の進化などはすべて、単一細胞シーケンシングによって解明できます。^[5] 単一細胞シーケンシングは、Nature Publishing Group によって 2013 年の手法に選ばれました。^[6]

単一細胞DNAゲノムシーケンシングでは、単一細胞を単離し、ゲノム全体または関心領域を増幅し、シーケンシングライブラリを構築し、次世代DNAシーケンシング（Illumina、Ion Torrentなど）を適用します。単一細胞DNAシーケンシングは、正常な生理機能と疾患を研究するために哺乳類システムに広く適用されています。単一細胞の解像度により、がんの発生や治療反応における遺伝的モザイクまたは腫瘍内遺伝的異質性の役割を明らかにすることができます。^[7]マイクロバイオームの文脈では、単一の単細胞生物からのゲノムは、単一増幅ゲノム（SAG）と呼ばれます。単一細胞DNAシーケンシングの進歩により、複雑なマイクロバイオームに存在する培養されていない原核生物種からゲノムデータを収集できるようになりました。^[8]  SAGは完全性が低く、バイアスが大きいという特徴がありますが、最近の計算技術の進歩により、複合SAGからほぼ完全なゲノムを組み立てることが可能になりました。^[9]微生物から得られたデータは、将来培養のプロセスを確立する可能性があります。^[10] 単一細胞シーケンスに使用されるゲノムアセンブリツールには、SPAdes、IDBA-UD、Cortex、HyDAなどがあります。^[11]

100種類以上の単一細胞オミクス手法のリストが公開されている。^[12]

多重置換増幅 (MDA)は広く使用されている技術で、細菌の DNA をフェムトグラムからマイクログラムに増幅して配列決定することができます。MDA 反応に必要な試薬には、ランダムプライマーとバクテリオファージ phi29 の DNA ポリメラーゼがあります。30 度の等温反応で、DNA は含まれている試薬で増幅されます。ポリメラーゼが新しい鎖を作ると、鎖置換反応が起こり、各テンプレート DNA から複数のコピーが合成されます。同時に、先に延長された鎖は置換されます。MDA 産物は約 12 kb の長さになり、最大約 100 kb の範囲で DNA 配列決定に使用できます。^[10] 2017年には、phi29ポリメラーゼの耐熱性変異体を利用することでこの技術に大きな改良が加えられ、特にG+C含有量の高い細胞からのゲノム回収率が向上しました。^[13] MDAは、高度に並列化された単一細胞全ゲノム増幅を実現するために、マイクロ流体液滴ベースのシステムにも実装されています。単一細胞を液滴に封入してDNAを捕捉・増幅することで、この方法は従来のMDAに比べてバイアスが低減し、スループットが向上します。^[14]

もう一つの一般的な方法はMALBACである。^[15] MDAと同様に、この方法は等温増幅で始まるが、プライマーは下流のPCR増幅のための「共通」配列で挟まれている。予備的なアンプリコンが生成されると、共通配列が自己連結と「ループ」の形成を促進し、さらなる増幅を防ぐ。MDAとは対照的に、高度に分岐したDNAネットワークは形成されない。代わりに、ループは別の温度サイクルで変性され、PCRで断片を増幅することができる。MALBACはマイクロ流体デバイスにも実装されているが、ナノリットルの液滴に封入しても増幅性能は大幅に向上しなかった。^[16]

MDA と MALBAC を比較すると、MDA はゲノム カバレッジが優れていますが、MALBAC はゲノム全体でより均一にカバレッジを提供します。MDA はSNP の特定に効果的である可能性がありますが、MALBAC はコピー数変異の検出に適しています。マイクロ流体デバイスを使用して MDA を実行すると、バイアスと汚染が大幅に減少しますが、MALBAC に関係する化学反応では、効率を向上させる同様の可能性は示されません。

ゲノム構造変異の発見に特に適した方法は、シングルセル DNA テンプレート ストランド シーケンシング(別名 Strand-seq)です。 ^[17]読み取り方向、読み取り深度、ハプロタイプ フェーズの共同モデリングを使用するシングルセル トライチャネル処理の原理を使用して、Strand-seq は、サイズが 200kb 以上の体細胞構造変異クラスの完全なスペクトルの発見を可能にします。Strand-seq は、単一細胞における体細胞遺伝的変異クラスの識別のための全ゲノム増幅ベースの方法の限界を克服します。^[18]これは、アーティファクトの呼び出しにつながる読み取りキメラの影響を受けず (以下のセクションで詳しく説明します)、ドロップアウトの影響も少ないためです。方法の選択は、各方法に異なる利点があるため、シーケンシングの目的によって異なります。^[7]

個々の細胞ゲノムの MDA は、非常に不均一なゲノム カバレッジ、つまりテンプレートのさまざまな領域の相対的な過剰表現と過少表現をもたらし、一部のシーケンスの損失につながります。このプロセスには 2 つの要素があります。a) ランダム領域の確率的な過剰増幅と過少増幅、および b) 高 GC % 領域に対する系統的な偏りです。確率的要素は、同じ細胞タイプからの単一細胞 MDA 反応をプールしたり、蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(FISH) やシーケンス後の確認を使用することで対処できます。^[10]高 GC % 領域に対する MDA の偏りは、WGA-X と呼ばれるプロセスなどの耐熱性ポリメラーゼを使用することで対処できます。^[13]

ヒトゲノムの遺伝的変異の大部分を占める一塩基多型（SNP）とコピー数変異（CNV）は、単一細胞シーケンシングにおいて問題を引き起こすだけでなく、単一細胞から抽出されるDNAの量が限られていることも問題となる。DNAの量が乏しいため、増幅後でもカバレッジが低くエラーが発生しやすいため、DNAの正確​​な分析には問題が生じる。MDAでは、平均ゲノムカバレッジは80％未満であり、シーケンシングリードでカバーされていないSNPは除外される。さらに、MDAではアレルドロップアウト率が高く、ヘテロ接合サンプルからアレルが検出されない。現在、さまざまなSNPアルゴリズムが使用されているが、単一細胞シーケンシングに固有のものはない。CNVを伴うMDAでは、実際のCNVを隠す偽のCNVを特定するという問題も生じる。これを解決するために、偽のCNVからパターンを生成できる場合、アルゴリズムはこのノイズを検出して排除し、真の変異体を生成することができる。^[19]

Strand-seq は、遺伝子変異呼び出しにおける全ゲノム増幅に基づく方法の限界を克服します。Strand-seq は、CNV またはコピー数バランスの構造変異クラスの境界 (またはブレークポイント) を横断するリード (またはリードペア) を必要としないため、変異ブレークポイントでのリードの欠落やリードキメラによる変異呼び出しのドロップアウトなど、全ゲノム増幅に基づく単一細胞法に共通するアーティファクトの影響を受けにくくなります。^{[7] [18]} Strand-seq は、切断-融合-ブリッジサイクルやクロモトリプシスイベント、バランスのとれた逆位、コピー数バランスまたは不均衡な転座など、少なくとも 200kb のサイズの構造変異クラスの完全なスペクトルを検出します。^[18] Strand-seqによる構造変異の呼び出しは染色体長ハプロタイプによって解決され、これによりさらなる変異呼び出しの特異性が提供されます。^{[18]現在の制限として、Strand-seqでは、}ブロモデオキシウリジン（BrdU）を使用した鎖特異的な標識のために分裂細胞が必要であり、この方法では可動要素挿入などのサイズが200kb未満の変異は検出されません。

微生物の大部分はほとんどの環境で培養が難しいため、マイクロバイオームは単一細胞ゲノミクスの主なターゲットの1つです。単一細胞ゲノミクスは、培養せずに微生物のゲノム配列を取得できる強力な方法です。このアプローチは、海洋、土壌、地下、生物、その他のタイプのマイクロバイオームに広く適用されており、微生物の生態学、進化、公衆衛生、バイオテクノロジーの可能性に関連するさまざまな問題に取り組んでいます。^{[20] [ 21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28]}

がんのシークエンシングも scDNAseq の新しい応用分野です。新鮮または凍結腫瘍は、全ゲノム DNAS アプローチを使用して、SCNA、SNV、および再編成に関して非常に適切に分析および分類できます。^[29]がん scDNAseq は、受容体チロシンキナーゼ遺伝子 (EGFR、PDGFRA など) などの増幅された治療ターゲットに存在する複雑性の深さと複合変異を調べるのに特に役立ちます。従来の集団レベルのアプローチでは、腫瘍の単一細胞内でのこれらの変異の共起パターンを解決できません。このような重複により、経路の活性化と腫瘍細胞の耐性が冗長化される可能性があります。

単一細胞DNAメチローム配列決定は、DNAメチル化を定量化します。自然界で発生するメチル化には、5-メチルシトシン（5mC）、5-ヒドロキシメチルシトシン（5hmC）、6-メチルアデノシン（6mA）、4-メチルシトシン（4mC）など、いくつかの種類が知られています。真核生物、特に動物では、5mCはゲノムに沿って広く分布しており、転移因子を抑制することで遺伝子発現を制御する重要な役割を果たしています。^[31]個々の細胞で5mCを配列決定すると、単一の組織または集団の遺伝的に同一の細胞におけるエピジェネティックな変化が、どのように異なる表現型の細胞を生み出すのかを明らかにすることができます。

亜硫酸水素塩シーケンシングは、単一細胞中の5mCの検出とシーケンシングにおけるゴールドスタンダードとなっている。^[32]亜硫酸水素塩でDNAを処理すると、シトシン残基がウラシルに変換されるが、5-メチルシトシン残基は影響を受けない。そのため、亜硫酸水素塩で処理されたDNAはメチル化されたシトシンのみを保持する。メチローム読み出しを得るために、亜硫酸水素塩処理された配列は、改変されていないゲノムにアラインメントされる。2014年には、単一細胞で全ゲノム亜硫酸水素塩シーケンシングが達成された。 ^[33]この方法は、亜硫酸水素塩による断片化の前にシーケンシングアダプターが追加される典型的な手順に関連するDNAの損失を克服する。代わりに、アダプターはDNAが亜硫酸水素塩で処理され断片化された後に追加され、すべての断片がPCRによって増幅されるようにする。^[34]ディープシーケンシングを使用すると、この方法では各細胞内の総CpGの約40％を捕捉できます。既存の技術では、5mCマークはポリメラーゼによってコピーされないため、亜硫酸水素塩処理の前にDNAを増幅することはできません。

単一細胞縮小表現型亜硫酸塩シーケンシング（scRRBS）は別の方法です。^[35]この方法は、メチル化シトシンがCpGアイランド（CGI）に集まる傾向を利用して、CpG含有量の高いゲノム領域を濃縮します。これにより、全ゲノム亜硫酸塩シーケンシングと比較してシーケンシングのコストが削減されますが、この方法の適用範囲が制限されます。RRBSをバルクサンプルに適用すると、遺伝子プロモーター内のCpGサイトの大部分が検出されますが、遺伝子プロモーター内のサイトはゲノム全体のCpGサイトの10％しか占めません。^[36]単一細胞では、バルクサンプルのCpGサイトの40％が検出されます。カバー範囲を広げるために、この方法を単一細胞の小さなプールに適用することもできます。20個のプールされた単一細胞のサンプルでは、​​バルクサンプルのCpGサイトの63％が検出されました。単一細胞をプールすることは、メチロームのカバレッジを増やすための 1 つの戦略ですが、細胞集団の異質性が不明瞭になるという代償を伴います。

亜硫酸水素塩シーケンシングは依然として5mC検出に最も広く使用されているアプローチですが、化学処理は過酷でDNAを断片化および劣化させます。この影響は、バルクサンプルから単一細胞に移行すると悪化します。DNAメチル化を検出する他の方法には、メチル化感受性制限酵素があります。制限酵素は、DpnIを使用した6mAなど、他のタイプのメチル化の検出も可能にします。^[37] ナノポアベースのシーケンシングは、元のDNAを断片化または変更することなく、直接メチル化シーケンシングするルートも提供します。ナノポアシーケンシングは、6mAと4mC（真核生物の5mCとは対照的）が支配的な細菌のメチロームのシーケンシングに使用されていますが、この技術はまだ単一細胞にスケールダウンされていません。^[38]

単一細胞DNAメチル化シーケンシングは、遺伝的に類似した細胞におけるエピジェネティックな違いを調べるために広く利用されてきた。これらの方法を開発中に検証するために、混合集団の単一細胞メチロームデータを階層的クラスタリングによって分類し、異なる細胞タイプを識別することに成功した。^[35]もう1つの応用は、初期発生における最初の数回の細胞分裂中の単一細胞を研究し、単一の胚から異なる細胞タイプがどのように出現するかを理解することです。^[39]単一細胞全ゲノム亜硫酸水素塩シーケンシングは、循環腫瘍細胞（CTC）など、がんにおけるまれではあるが非常に活発な細胞タイプの研究にも利用されてきました。^[40]

単一細胞トランスポザーゼアクセス可能なクロマチンシークエンシングは、ゲノム全体のクロマチンアクセシビリティをマッピングします。トランスポザーゼは、クロマチンのオープン領域にシークエンシングアダプターを直接挿入し、それらの領域を増幅してシークエンシングできるようにします。^[41]

scATAC-Seq におけるライブラリ準備の 2 つの方法は、分割プール細胞インデックス作成とマイクロ流体工学に基づいています。

マイクロアレイやバルクRNA-seqなどの標準的な方法は、大規模な細胞集団からのRNA発現を解析する。これらの測定では、混合細胞集団内の個々の細胞間の重要な違いが不明瞭になる可能性がある。^{[42] [43]}

単一細胞RNAシーケンシング（scRNA-seq）は、個々の細胞の発現プロファイルを提供し、 2020年現在、細胞の状態と表現型を定義するためのゴールドスタンダードと考えられています。 ^[44]利用可能な材料の量が少ないため、各細胞によって発現されるすべてのRNAに関する完全な情報を取得することは不可能ですが、遺伝子クラスタリング解析を通じて遺伝子発現パターンを特定できます。^[45]これにより、細胞集団内のこれまでに見られなかった希少な細胞タイプを発見できます。たとえば、神経芽腫の腫瘍組織でscRNA-seqを実行しているある科学者グループは、新しい治療法に魅力的な可能性のある希少な汎神経芽腫癌細胞を特定しました。^[46]

現在の scRNA-seq プロトコルでは、単一細胞とその RNA を分離し、その後、バルク RNA-seq と同じ手順、つまり逆転写(RT)、増幅、ライブラリ生成、およびシーケンシングを実行します。初期の方法では、個々の細胞を別々のウェルに分離していましたが、最近の方法では、個々の細胞をマイクロ流体デバイス内の液滴にカプセル化し、逆転写反応を起こして RNA を cDNA に変換します。各液滴には、単一細胞から得られた cDNA を一意にラベル付けする DNA「バーコード」が付いています。逆転写が完了すると、特定の細胞からの転写産物は一意のバーコードによって識別されるため、多くの細胞からの cDNA を混合してシーケンシングできます。^{[47] [48]}

scRNA-Seqの課題には、細胞内のmRNAの初期の相対的豊富さを維持し、希少な転写産物を特定することが含まれます。^[49]逆転写反応の効率によって、最終的にシーケンサーによって分析される細胞のRNA集団の量が決まるため、逆転写ステップは非常に重要です。逆転写酵素のプロセッシング能力と使用されるプライミング戦略は、完全長cDNAの生成と、遺伝子の3'末端または5'末端に偏ったライブラリの生成に影響を与える可能性があります。

増幅ステップでは、現在、PCR または in vitro 転写 (IVT) のいずれかを使用して cDNA を増幅しています。PCR ベースの方法の利点の 1 つは、完全長 cDNA を生成できることです。ただし、特定の配列 (GC 含有量やスナップバック構造など) に対する異なる PCR 効率も指数関数的に増幅され、カバレッジが不均一なライブラリが生成されることがあります。一方、IVT によって生成されたライブラリは PCR 誘発性の配列バイアスを回避できますが、特定の配列が非効率的に転写され、配列のドロップアウトが発生したり、不完全な配列が生成されたりする可能性があります。^{[1] [42]} いくつかの scRNA-seq プロトコルが公開されています: Tang ら、^[50] STRT、^[51] SMART-seq、^[52 ] SORT-seq、^[53] CEL-seq、^[54] RAGE-seq、^[55] Quartz-seq。^[56] 、および C1-CAGE。^{[57]これらのプロトコルは、逆転写、cDNA合成および増幅の戦略、配列特異的バーコード（} UMI）に対応する可能性、またはプールされたサンプルを処理する能力の点で異なります。 ^[58]

2017年には、REAP-seq ^[59]とCITE-seq ^{[60]として知られるオリゴヌクレオチド標識抗体を介して単一細胞のmRNAとタンパク質の発現を同時に測定する2つのアプローチが導入されました。電気生理学的記録に続いてパッチクランプを使用して細胞の内容物を収集することで、} Patch-Seq法 の開発も可能になり、神経科学で着実に普及しています。^[61]

この単一細胞RNAシーケンシングのプラットフォームは、マイクロ流体パーティショニングを使用して単一細胞を捕捉し、次世代シーケンシング（NGS）cDNAライブラリを準備することで、細胞ごとにトランスクリプトームを分析することを可能にします。^[62]液滴ベースのプラットフォームは、油滴で単一細胞を捕捉することにより、多数の個々の細胞内のmRNAの大規模並列シーケンシングを可能にします。^[63]

全体的に、第一段階では個々の細胞を別々に捕獲して溶解し、次にmRNAの逆転写（RT）を行ってcDNAライブラリを得る。mRNAを選択するために、mRNA分子のポリ（A）テールに特異的に結合するデオキシチミン（オリゴdT）プライマーの一本鎖配列を用いてRTを行う。その後、増幅されたcDNAライブラリを配列決定に使用する。^[64]

したがって、この方法の最初のステップは、単一細胞のカプセル化とライブラリの準備です。細胞は、自動化によってゲルビーズインエマルジョン（GEM）にカプセル化されます。これらの小胞を形成するために、自動化はマイクロ流体チップを使用し、すべての成分をオイルと組み合わせます。各機能的GEMには、単一細胞、単一のゲルビーズ、およびRT試薬が含まれています。ゲルビーズには、4つの異なる部分で構成されるオリゴヌクレオチドが結合しています：PCRプライマー（シーケンシングに必須）、10Xバーコード化オリゴヌクレオチド、ユニーク分子識別子（UMI）配列、ポリdT配列（ポリアデニル化mRNA分子の捕捉を可能にする）。^[65] 各GEM反応小胞内で、単一細胞が溶解され、逆転写が行われます。同じ細胞からのcDNAは、共通の10Xバーコードによって識別されます。さらに、UMIの数は遺伝子発現レベルを表し、その分析により非常に変動の大きい遺伝子を検出することができます。これらのデータは、細胞表現型の分類や新しいサブポピュレーションの識別によく使用されます。^[66]

プラットフォームの最終ステップはシーケンシングです。生成されたライブラリは、単一細胞全体のトランスクリプトームシーケンシングまたはターゲットシーケンシングワークフローに直接使用できます。シーケンシングは、イルミナのダイシーケンシング法を使用して実行されます。このシーケンシング法は、合成によるシーケンシング（SBS）原理と、各単一ヌクレオチドの識別を可能にする可逆的なダイターミネーターの使用に基づいています。一方の端の転写配列ともう一方の端のバーコードとUMIを読み取るには、ペアエンドシーケンシングリーダーが必要です。^[67]

ドロップレットベースのプラットフォームは、その高いスループットにより、希少な細胞タイプの検出が可能です。実際、1 つの細胞懸濁液からサンプルごとに 500 ～ 10,000 個の細胞が捕捉されます。プロトコルは簡単に実行でき、最大 65% の高い細胞回収率を実現します。ドロップレットベースのプラットフォームの全体的なワークフローは 8 時間で、10 時間かかるマイクロウェルベースの方法 (BD Rhapsody) よりも高速です。ただし、新鮮なサンプルが必要であり、最終的に mRNA が 10% しか検出されないという制限があります。

液滴ベースの方法とマイクロウェルベースの方法の主な違いは、細胞を分割するために使用される技術です。^[64]

ほとんどのRNA-seq法は、ポリ(A)テールキャプチャーを利用してmRNAを濃縮し、豊富で情報価値のないrRNAを枯渇させます。そのため、多くの場合、ポリアデニル化mRNA分子のシーケンシングに限定されます。しかし、最近の研究では、遺伝子発現制御における長鎖非コードRNAやマイクロRNAなどの非ポリ(A)RNAの重要性が認識され始めています。スモールシーケンスは、哺乳類細胞内のマイクロRNA、tRNAの断片、小さな核小体RNAなどの小さなRNA（<300ヌクレオチド）を捕捉する単一細胞法です。^[68]この方法では、「オリゴヌクレオチドマスク」（非常に豊富な5.8S rRNA分子の捕捉を阻害する）とサイズ選択を組み合わせて、他の非常に豊富なrRNA分子などの大きなRNA種を除外します。長い非コードmRNA、ヒストンmRNA、環状RNA、エンハンサーRNAなどのより大きな非ポリ(A)RNAをターゲットとするには、非常に豊富なリボソームRNA分子(18Sおよび28s rRNA)を枯渇させるためにサイズ選択は適用できません。^[69]シングルセルRamDA-Seqは、rRNA分子へのプライミングを避けるように特別に設計された「それほどランダムではない」(NSR)プライマーの存在下でランダムプライミング(ランダム置換増幅)による逆転写を実行することによってこれを実現する方法です。^[70]この方法は、シーケンス用の全長全RNA転写産物を正常にキャプチャし、さまざまな非ポリ(A)RNAを高感度で検出しましたが、いくつかの制限があります。NSRプライマーは特定の生物(マウス)のrRNA配列に従って慎重に設計されており、他の種用に新しいプライマーセットを設計するにはかなりの労力がかかります。最近、CRISPRベースのscDASH（ハイブリダイゼーションによる豊富な配列の単一細胞枯渇）と呼ばれる方法が、単一細胞トータルRNA-seqライブラリからrRNA配列を枯渇させる別のアプローチを実証しました。^[71]

細菌やその他の原核生物は、ポリアデニル化mRNAが欠如しているため、現在、単一細胞RNA-seqには適していません。したがって、ポリ(A)テールキャプチャに依存しない単一細胞RNA-seq法の開発は、単一細胞解像度のマイクロバイオーム研究を可能にする上でも役立ちます。バルク細菌研究では、通常、細菌のポリアデニル化mRNAの欠乏を克服するために一般的なrRNA枯渇を適用しますが、単一細胞レベルでは、1つの細胞に含まれる総RNAが少なすぎます。^[69]ポリアデニル化mRNAの欠如と単一の細菌細胞に含まれる総RNAの希少性は、細菌におけるscRNA-seqの展開を制限する2つの重要な障壁です。

scRNA-Seqは、発生生物学^[72] 、神経学^[73] 、腫瘍学^{[74] 、 [75 ]、[ 76]、} 免疫学^[77]、^[78]、心血管研究^[79]、[80]、感染症^{[81]、[82]など}の生物学分野で広く使用されるようになっています。

機械学習の手法を用いて、バルクRNA-Seqのデータを使用してscRNA-Seqの信号対雑音比を高めてきました。具体的には、科学者は全癌データセットからの遺伝子発現プロファイルを使用して共発現ネットワークを構築し、次にこれを単一細胞遺伝子発現プロファイルに適用して、転写レベルを使用して個々の細胞の変異の存在を検出するより堅牢な方法を得ました。^[83]

scRNA-seq法の中には、単一細胞微生物に適用されているものもある。SMART-seq2は単一細胞真核微生物の解析に使用されているが、ポリ(A)テールキャプチャーに依存しているため、原核細胞には適用されていない。^[84] Drop-seqやFluidigm IFC-C1デバイスなどのマイクロ流体アプローチは、単一のマラリア原虫または単一の酵母細胞の配列決定に使用されている。^{[85] [86]}単一細胞酵母研究では、酵母が塩ストレスにさらされる前と後の同質酵母細胞における不均一なストレス耐性を特徴付けようとした。scRNA-seqによるいくつかの転写因子の単一細胞解析により、集団全体で不均一性が明らかになった。これらの結果は、集団のメンバー間で調節が異なり、集団の一部の生存の可能性を高めていることを示唆している。

原核生物種における最初の単一細胞トランスクリプトーム解析は、rRNAを選択的に分解するターミネーターエキソヌクレアーゼ酵素とmRNAのローリングサークル増幅（RCA）を使用して達成されました。^[87]この方法では、一本鎖DNAの末端を連結して環状にし、得られたループを線形RNA増幅のテンプレートとして使用しました。その後、最終産物ライブラリーをマイクロアレイで解析したところ、バイアスが低く、カバレッジが良好でした。しかし、RCAは、次世代シーケンシングを通常使用するRNA-seqではテストされていません。細菌の単一細胞RNA-seqは、マイクロバイオームの研究に非常に有用です。これにより、少量存在する種を捕捉できなかったり、細胞集団間の異質性を解決できなかったりするなど、従来のバルクメタトランスクリプトミクスアプローチで遭遇する問題が解決されます。

scRNA-Seqは、線虫Caenorhabditis elegans ^[88]、再生プラナリアSchmidtea mediterranea ^{[89] [90]}、アホロートルAmbystoma mexicanum ^{[91] [92]}などの胚や生物の発生に関する大きな知見を提供してきました。この方法でマッピングされた最初の脊椎動物は、ゼブラフィッシュ^{[93] [94] [95]}とアフリカツメガエルでした。^[96]いずれの場合も、胚の複数の段階が研究され、発生の全プロセスを細胞ごとにマッピングすることができました。サイエンス誌は、これらの進歩を2018年のブレークスルー・オブ・ザ・イヤーとして認めました。^[97]

ScRNA-seqアプローチを用いてBDE47誘発性思春期前精巣毒性を定義するためにマウス精巣の分子細胞アトラスが確立され、単一細胞解像度でBDE47関連精巣障害に関与する基礎メカニズムと経路の理解に新たな洞察がもたらされました。^[98]

全ゲノム増幅および配列決定の前に個々の細胞を分離する方法はいくつかある。 蛍光活性化細胞選別（FACS）は広く使用されているアプローチである。個々の細胞は、段階希釈やパッチピペットまたはナノチューブを使用して単一細胞を収穫するなどのマイクロマニピュレーションによって収集することもできる。^{[15] [99]} マイクロマニピュレーションの利点は、容易で低コストであるが、手間がかかり、顕微鏡下で細胞タイプを誤認する可能性がある。レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM）も単一細胞の収集に使用できる。LCMは、組織内でのサンプル細胞の空間的位置に関する知識を保持するが、隣接する細胞から材料も収集せずに単一細胞全体を捕捉することは困難である。^{[42] [100] [101]単一細胞を分離するための} 高スループット方法には、マイクロフルイディクスも含まれる。FACSとマイクロフルイディクスはどちらも正確で自動化されており、偏りのないサンプルを分離することができる。しかし、どちらの方法もまず細胞をその微小環境から切り離す必要があり、それによってRNA発現解析における転写プロファイルに乱れが生じる。^{[102] [103]}

シングルセルRNA-SeqプロトコルはRNAキャプチャの効率が異なり、その結果、各シングルセルから生成される転写産物の数に違いが生じます。シングルセルライブラリは通常、1,000,000リードの深さまでシーケンスされます。これは、遺伝子の大部分が500,000リードで検出されるためです。^[104]細胞数を増やしてリード深度を低くすると、主要な細胞集団を識別する力が高まります。しかし、リード深度が低いと、必ずしも遺伝子に関する必要な情報が得られるとは限らず、細胞集団間の発現の違いはmRNA分子の安定性と検出に依存します。

品質管理共変量は、細胞数を分析するための戦略として機能します。これらの共変量には主に、カウント深度、遺伝子数、ミトコンドリア遺伝子からのカウントの割合に基づくフィルタリングが含まれ、細胞信号の解釈につながります。

• 単一細胞解析
• 単一細胞トランスクリプトミクス
• 単一細胞エピゲノミクス
• Tcr-seq
• DNA配列解析
• 全ゲノム配列解析