リピドミクス

リピドミクスは、生物系における細胞脂質の経路とネットワークの大規模な研究です。 ^{[1] [2] [3] 「}リピドーム」という言葉は、細胞、組織、生物、または生態系内の完全な脂質プロファイルを説明するために使用され、「メタボローム」のサブセットであり、他の主要な生物学的分子のクラス（アミノ酸、糖、解糖系とTCA中間体、核酸など）も含まれています。リピドミクスは、質量分析（MS）、核磁気共鳴（NMR）分光法、蛍光分光法、二重偏光干渉法、計算方法などの技術の急速な進歩と、肥満、アテローム性動脈硬化症、脳卒中、高血圧、糖尿病などの多くの代謝性疾患における脂質の役割の認識によって推進されてきた比較的最近の研究分野です。この急速に拡大している分野^[4]は、システム生物学のファミリーを構成するゲノミクスとプロテオミクスの大きな進歩を補完します。

リピドミクス研究では、何千もの細胞脂質分子種と、それらの他の脂質、タンパク質、その他の代謝物との相互作用を識別および定量化します。リピドミクスの研究者は、細胞脂質の構造、機能、相互作用、ダイナミクス、およびシステムの摂動中に発生する変化を調べます。

ハンとグロス^{[5]は、脂質分子種に固有の特定の化学的性質を包括的な質量分析アプローチと統合することにより、初めて脂質組成学の分野を定義しました。脂質組成学は、より一般的な「}メタボロミクス」の傘下にありますが、脂質が他の代謝産物に比べて独自性と機能的特異性を持っているため、脂質組成学自体は独自の分野です。

リピドミクス研究では、細胞の生理的または病理的状態の変化による摂動後に、さまざまな脂質分子種の含有量と組成の空間的および時間的変化を定量的に記述する膨大な量の情報が得られます。これらの研究から得られる情報は、細胞機能の変化に対するメカニズムの洞察を促進します。したがって、リピドミクス研究は、細胞の脂質代謝、輸送、恒常性の変化を特定することにより、脂質関連疾患プロセスの生化学的メカニズムを定義する上で重要な役割を果たします。脂質研究への注目の高まりは、LIPID代謝物および経路戦略（LIPID MAPSコンソーシアム）^[6]および欧州リピドミクスイニシアチブ（ELIfe）^{[7]の進行中のイニシアチブからも明らかです。}

脂質は、細胞膜の構造成分として機能したり、エネルギー貯蔵源として機能したり、シグナル伝達経路に関与したりするなど、多くの重要な生物学的機能を持つ、多様で遍在的な化合物のグループです。脂質は、ケトアシル基とイソプレン基という 2 つの異なるタイプの生化学的サブユニットまたは「構成要素」から完全にまたは部分的に生じる疎水性または両親媒性の小分子として広く定義できます。 ^[8]脂質に見られる膨大な構造的多様性は、これらの構成要素のさまざまな組み合わせの生合成から生じます。たとえば、グリセロリン脂質は、約 10 の可能なヘッドグループの 1 つと 2 つの脂肪アシル/アルキル鎖にリンクされたグリセロール骨格で構成されており、これらの鎖は 30 以上の異なる分子構造を持つ場合があります。実際には、細胞の種類によって異なる鎖の好みや検出限界があるため、実験的にすべての可能な順列が検出されるわけではありませんが、それでも数百の異なるグリセロリン脂質分子種が哺乳類細胞で検出されています。

しかし、植物の葉緑体チラコイド膜はリン脂質が欠乏しているため、独特の脂質組成を持っています。また、その最大成分であるモノガラクトシルジグリセリド（MGDG）は水性二重層を形成しません。しかし、動的研究ではチラコイド膜に正常な脂質二重層組織があることが明らかになっています。^[9]

生体サンプルからの脂質抽出および単離のほとんどの方法は、有機溶媒への炭化水素鎖の高い溶解性を利用しています。脂質クラスの多様性を考えると、共通の抽出方法ですべてのクラスに対応することは不可能です。従来のBligh/Dyer法^{[10]では、有機層への相分離を含む}クロロホルム/メタノールベースのプロトコルを 使用します。ただし、現在ではいくつかのプロトコルが存在し、新しい方法は古い方法の欠点を克服し、たとえば標的脂質単離またはハイスループットデータ収集に関連する問題を解決しています^[11] 。ほとんどのプロトコルは、さまざまな生理学的に関連する脂質に対して比較的うまく機能しますが、特定の特性を持つ種や、存在量が少なく不安定な脂質代謝物には適応させる必要があります^{[12] [13] [14] [15] [16] [17]} 。

脂質を分離する最も簡単な方法は、薄層クロマトグラフィー（TLC）を使用することです。他の脂質検出方法ほど感度は高くありませんが、より感度が高く洗練された技術の前に、迅速かつ包括的なスクリーニングツールを提供します。固相抽出（SPE）クロマトグラフィーは、粗脂質混合物を異なる脂質クラスに迅速に分取分離するのに役立ちます。これには、シリカまたはその他の固定相を含むプレパックカラムを使用して、グリセロリン脂質、脂肪酸、コレステロールエステル、グリセロ脂質、およびステロールを粗脂質混合物から分離します。^[18] 高性能液体クロマトグラフィー（HPLCまたはLC）は、質量分析の前に脂質を分離するためにリピドミクス分析で広く使用されています。分離は、順相（NP）HPLCまたは逆相（RP）HPLCのいずれかで行うことができます。例えば、NP-HPLCはグリセロリン脂質をヘッドグループの極性に基づいて効果的に分離しますが、^[19] RP-HPLCはエイコサノイドなどの脂肪酸を鎖長、不飽和度、置換に基づいて効果的に分離します。^[20]グローバルな非標的リピドミクス研究では、リピドームのカバレッジを高めるために、RPとNPの両方、または親水性相互作用液体クロマトグラフィー（HILC）カラムを使用するのが一般的です。ナノフロー液体クロマトグラフィー（nLC）の適用は、グローバルなリピドミクスアプローチの一般的な測定感度とリピドームのカバレッジの両方を高めるのに最も効率的であることが証明されています。^[21]脂質のクロマトグラフィー（HPLC/UHPLC）分離は、溶出液が質量分析計のイオン化源と統合されるオンラインでもオフラインでも実行できます。

現代の脂質分析の進歩は、一般的な分光法や、特にエレクトロスプレーイオン化（ESI）^{[5] 、}脱離エレクトロスプレーイオン化（DESI）^[22]、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（MALDI）^{[23]などの}質量分析のためのソフトイオン化技術の開発によって大きく加速されました。「ソフト」イオン化は広範な断片化を引き起こさないため、複雑な混合物内の脂質の全範囲を包括的に検出し、実験条件や病状と相関させることができます。さらに、大気圧化学イオン化（APCI）技術は、非極性脂質の分析にますます普及しています。^[24]

ESI-MS は、当初、 Fennらが生体分子の分析のために開発しました。 ^[25]これは、極性、熱不安定性、およびほとんどが非揮発性の分子からガスイオンを形成することに依存しているため、さまざまな脂質に完全に適しています。これはソフトイオン化法であり、質量分析の前に分析物の化学的性質が破壊されることはほとんどありません。さまざまな ESI-MS 法が、生物学的抽出物からさまざまなクラス、サブクラス、および個々の脂質種を分析するために開発されました。これらの方法とその適用に関する包括的なレビューが最近公開されました。^[26] ESI-MS の主な利点は、高い精度、感度、再現性、および事前の誘導体化なしで複雑な溶液に適用できることです。Han らは、「ショットガン リピドミクス」と呼ばれる方法を開発しました。これは、脂質の固有の電気的特性に基づいて脂質をソース内分離するために最適化された ESI ソースに粗脂質抽出物を直接注入するものです。^[27]

DESI質量分析法は、パデュー大学のグラハム・クックス教授のグループのゾルタン・タカッツ教授らが開発したアンビエントイオン化技術です。^[22]これは、ESIと脱離イオン化技術を組み合わせたもので、数ミリメートル離れたサンプル表面に帯電したミストを向けます。^[28]この技術は、組織標本内の脂質分布をマッピングするためのイメージングツールとして脂質分析にうまく適用されています。^[29] DESI MSの利点の1つは、組織の準備にマトリックスが不要なため、同じ組織標本で複数の連続測定が可能なことです。DESI MSは、組織切片からの脂質のイメージングにも使用できます。^[30]

MALDI質量分析法は、レーザーベースのソフトイオン化法で、大きなタンパク質の分析によく使用されますが、脂質にも効果的に使用されています。脂質は、2,5-ジヒドロキシ安息香酸などのマトリックスと混合され、小さなスポットとしてサンプルホルダーに適用されます。レーザーがそのスポットに照射され、マトリックスがエネルギーを吸収し、それが分析対象物に伝達されて分子がイオン化されます。MALDI-飛行時間型（MALDI-TOF）MSは、脂質組成研究、特に組織スライドからの脂質の画像化に非常に有望なアプローチとなっています。^[31]

APCIのイオン源はESIと似ていますが、イオンは加熱された分析対象溶媒と高電位に設定されたコロナ放電針との相互作用によって形成されます。一次イオンは針のすぐ周囲に形成され、これが溶媒と相互作用して二次イオンを形成し、最終的にサンプルをイオン化します。APCIは、トリアシルグリセロール、ステロール、脂肪酸エステルなどの非極性脂質の分析に特に役立ちます。^[32]

脂質範囲におけるDESIの高感度は、組織標本内の脂質存在量の検出およびマッピングのための強力な技術となっている。^[33] MALDI法の最近の進歩により、脂質をその場で直接検出することが可能となった。MALDIマトリックスでコーティングされた組織表面全体で連続スペクトルを取得すると、薄い組織切片を直接分析することで、豊富な脂質関連イオンが生成されます。分子イオンの衝突活性化を使用して脂質ファミリーを決定し、多くの場合、分子種を構造的に定義することができます。これらの技術により、心臓、腎臓、脳などの組織内のリン脂質、スフィンゴ脂質、グリセロ脂質を検出できます。さらに、多くの異なる脂質分子種の分布により、これらの組織内の解剖学的領域が定義されることがよくあります。^{[34] [35]}

脂質プロファイリングは、細胞または組織内の脂質種の包括的な分析を提供する標的メタボロミクスプラットフォームです。エレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析（ESI-MS/MS）に基づくプロファイリングは、定量的なデータを提供することができ、ハイスループット分析に適応できます。^[37]遺伝子産物の欠失や過剰発現と脂質組成を組み合わせたトランスジェニックの強力なアプローチは、生化学的経路の役割について貴重な洞察を与えることができます。^{[38]脂質プロファイリング技術は、植物[39]}や酵母などの微生物にも適用されています。 ^{[36] [40] [21]}定量的な脂質組成データと、対応する転写データ（遺伝子アレイ法を使用）およびプロテオームデータ（タンデムMSを使用）を組み合わせることで、システム生物学アプローチが可能になり、関心のある代謝経路またはシグナル伝達経路をより深く理解することができます。

リピドミクス、特に MS ベースのアプローチにおける大きな課題は、情報取得と処理の連鎖に沿ったさまざまな段階で発生する大量のデータを処理するための計算およびバイオインフォマティクスの要件にあります。^{[41] [42]}クロマトグラフィーおよび MS データ収集には、スペクトルのアライメントと信号強度の変動の統計的評価に多大な労力が必要です。このような変動には、生物学的変動、サンプルの取り扱い、分析精度など、さまざまな原因があります。その結果、複雑な混合物中の脂質レベルを信頼性高く測定するには、通常、複数の反復が必要です。ここ数年で、脂質を含む代謝物の MS プロファイリングによって生成されたデータを分析するためのソフトウェア パッケージが、さまざまな企業や研究グループによって多数開発されました。差分プロファイリングのデータ処理は通常、入力ファイルの操作、スペクトル フィルタリング、ピーク検出、クロマトグラフィーのアライメント、正規化、視覚化、およびデータ エクスポートを含むいくつかの段階を経て行われます。代謝プロファイリング ソフトウェアの例としては、無料で入手できる Java ベースの Mzmine アプリケーションがあります。^[43]もう1つは、Metabolon, Inc. が独自ソフトウェアを使用してメタボロミクス解析を行う商用アプリケーションです。^[44]最近、MS-DIAL 4 ソフトウェアは、117 の脂質サブクラスと 8,051 の脂質の保持時間、衝突断面積、タンデム質量分析情報を含む包括的なリピドーム アトラスと統合されました。^{[45] Markerview [46]}な​​どの一部のソフトウェア パッケージには、多変量統計解析 (主成分分析など) が含まれており、特に脂質ベースのバイオマーカーの開発において、生理学的表現型に関連する脂質代謝物の相関関係の特定に役立ちます。リピドミクスの情報技術側のもう1つの目的は、脂質構造および脂質関連タンパク質と遺伝子に関するデータから代謝マップを構築することです。これらの脂質経路の一部^[47]は、たとえば哺乳類のスフィンゴ糖脂質経路など、極めて複雑です。^[48]脂質および脂質関連遺伝子/タンパク質の検索可能でインタラクティブなデータベース^{[49] [50]の構築も、脂質学コミュニティの参考資料として非常に重要なリソースです。これらのデータベースをMSやその他の実験データ、代謝ネットワーク[51]}と統合することで、脂質関連プロセスの機能不全を伴うこれらの病理学的状態を予防または逆転させるための治療戦略を考案する機会が生まれます。

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