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ペプチド質量フィンガープリンティング（PMF ）は、タンパク質フィンガープリンティングとも呼ばれ、タンパク質を同定するための分析技術であり、まず、対象の未知のタンパク質をより小さなペプチドに切断し、その絶対質量をMALDI-TOFやESI-TOFなどの質量分析計で正確に測定します。[1]この方法は、1993年にいくつかのグループによって独立して開発されました。[2] [3] [4] [5] [6]ペプチドの質量は、既知のタンパク質配列を含むデータベース、またはゲノムと比較されます。これは、生物の既知のゲノムをタンパク質に変換し、次に理論的にタンパク質をペプチドに切断し、各タンパク質からペプチドの絶対質量を計算するコンピュータプログラムを使用することで実現されます。次に、未知のタンパク質のペプチドの質量を、ゲノムにコードされている各タンパク質の理論的なペプチド質量と比較します。
この方法の利点は、ペプチドの質量だけがわかればよいことです。欠点は、タンパク質配列が対象のデータベースに存在しなければならないことです。さらに、ほとんどの PMF アルゴリズムでは、ペプチドが単一のタンパク質に由来するものと想定しています。[7]混合物が存在すると、分析が著しく複雑になり、結果が損なわれる可能性があります。PMF ベースのタンパク質同定では、通常、単離されたタンパク質が必要です。2～3 を超えるタンパク質の混合物では、十分な識別特異性を達成するために、通常、MS/MSベースのタンパク質同定を追加で使用しなければなりません。したがって、典型的な PMF サンプルは、2 次元ゲル電気泳動(2D ゲル) から単離されたタンパク質または単離されたSDS-PAGEバンドです。MS /MSによる追加の分析は、直接分析 (例: MALDI-TOF/TOF 分析) またはゲルスポット溶出液の下流の nanoLC-ESI-MS/MS 分析のいずれかです。[7] [8]
起源
タンパク質を分析するプロセスは長くて面倒なため、ペプチドマスフィンガープリンティングが開発されました。タンパク質分析ではエドマン分解法が使用され、1つのアミノ酸残基を分析するのにほぼ1時間を要しました。[9] SDS-PAGEも非常に複雑な混合物からタンパク質を分離するために使用され、電気ブロッティングと染色の方法も採用されました。[10]次に、バンドがゲルから抽出され、自動的に配列決定されます。このプロセスで繰り返し発生する問題は、干渉タンパク質も目的のタンパク質と一緒に精製されることでした。これらの干渉タンパク質の配列は、Dayhoffデータベースとして知られるようになったものにまとめられました。[11]最終的に、これらの既知のタンパク質汚染物質の配列をデータベースに格納することで、タンパク質分析にかかる機器の時間と費用が削減されました。
サンプルの準備
タンパク質サンプルはSDS-PAGE [7]または逆相HPLCから得られ、その後、いくつかの化学修飾を受ける。タンパク質中のジスルフィド結合は還元され、システインアミノ酸はゲル電気泳動中に化学的にカルバミドメチル化またはアクリルアミド化される。
次に、タンパク質はトリプシン、キモトリプシン、Glu-Cなどのタンパク質分解酵素を使用していくつかの断片に切断されます。典型的なサンプル:プロテアーゼ比は50:1 です。タンパク質分解は通常一晩行われ、結果として得られたペプチドはアセトニトリルで抽出され、真空下で乾燥されます。次に、ペプチドは少量の蒸留水に溶解されるか、さらに濃縮および精製され、質量分析の準備が整います。
質量分析
消化されたタンパク質は、ESI-TOFやMALDI-TOFなどのさまざまなタイプの質量分析計で分析できます。MALDI-TOFは、サンプルスループットが高く、 MS/MS分析を補完すれば1回の実験で複数のタンパク質を分析できるため、多くの場合好まれる機器です。LC/ESI-MSとCE/ESI-MSもペプチド質量フィンガープリンティングに最適な技術です。[12] [13]
ペプチドの少量（通常1マイクロリットル以下）をMALDIターゲット上にピペットで移し、マトリックスと呼ばれる化学物質をペプチド混合物に加えます。一般的なマトリックスは、シナピン酸、アルファ-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸、および2,3-ジヒドロキシ安息香酸です。マトリックス分子は、ペプチド分子の脱着に必要です。マトリックスとペプチド分子はMALDIターゲット上で共結晶化し、分析の準備が整います。主にMALDI-MSサンプル調製技術が1つあり、それは乾燥液滴技術です。[14]ターゲットは質量分析計の真空チャンバーに挿入され、ポリペプチド断片の脱着とイオン化は、大量のエネルギーをマトリックス分子に伝達するパルスレーザービームによって開始されます。エネルギー伝達は、マトリックス分子とペプチドのイオン化と固相から気相への移行を促進するのに十分です。イオンは質量分析計の電界で加速され、イオン検出器に向かって飛行し、その到着が電気信号として検出されます。イオンの質量電荷比はドリフトチューブ内の飛行時間(TOF) に比例し、それに応じて計算できます。
ESIとキャピラリーLCを組み合わせると、ペプチドをタンパク質消化物から分離し、同時に分子量を測定することができます。 [15] キャピラリー電気泳動とESI-MSを組み合わせるのも別の技術ですが、少量のタンパク質を分析する場合に最適です。[13]
計算分析
質量分析では、ピーク リストと呼ばれる分子量のリストが生成されます。ペプチドの質量は、タンパク質配列情報を含むSwissprotなどのタンパク質データベースと比較されます。ソフトウェアは、化学分解反応で使用されるのと同じ酵素 (トリプシンなど) を使用して、データベース内のタンパク質をコンピューターで消化します。次に、これらのペプチドの質量が計算され、測定された質量のピーク リストと比較されます。結果は統計的に分析され、一致する可能性のあるものが結果テーブルに返されます。
参照
参考文献
- ^ Clauser KR、Baker P、Burlingame AL (1999)。「MS または MS/MS とデータベース検索を用いたタンパク質同定戦略における正確な質量測定 (+/- 10 ppm) の役割」。Anal . Chem . 71 (14): 2871–82. doi :10.1021/ac9810516. PMID 10424174。
- ^ Pappin DJ、Hojrup P、Bleasby AJ (1993)。「ペプチド質量フィンガープリンティングによるタンパク質の迅速な同定」。Curr . Biol . 3 (6): 327–32. Bibcode :1993CBio....3..327P. doi :10.1016/0960-9822(93)90195-T. PMID 15335725. S2CID 40203243.
- ^ Henzel WJ、Billeci TM、Stults JT、Wong SC、Grimley C、Watanabe C (1993)。「タンパク質配列データベースにおけるペプチド断片の分子量検索による2次元ゲルからのタンパク質の識別」。Proc . Natl. Acad. Sci . USA . 90 (11): 5011–5。Bibcode : 1993PNAS ...90.5011H。doi : 10.1073 / pnas.90.11.5011。PMC 46643。PMID 8506346。
- ^ Mann M、 Højrup P、 Roepstorff P (1993)。「質量分析分子量情報を使用した配列データベース内のタンパク質の識別」。生物学的質量分析。22 (6): 338–45。doi :10.1002/bms.1200220605。PMID 8329463 。
- ^ James P, Quadroni M, Carafoli E, Gonnet G (1993). 「質量プロファイルフィンガープリンティングによるタンパク質同定」. Biochem. Biophys. Res. Commun . 195 (1): 58–64. doi :10.1006/bbrc.1993.2009. PMID 8363627.
- ^ Yates JR、Speicher S、Griffin PR、Hunkapiller T (1993)。「ペプチド質量マップ：タンパク質同定のための非常に有益なアプローチ」。Anal . Biochem . 214 (2): 397–408. doi :10.1006/abio.1993.1514. PMID 8109726。
- ^ abc Shevchenko A, Jensen ON, Podtelejnikov AV, Sagliocco F, Wilm M, Vorm O, Mortensen P, Shevchenko A, Boucherie H, Mann M (1996). 「質量分析によるゲノムとプロテオームのリンク：2次元ゲルからの酵母タンパク質の大規模同定」Proc. Natl. Acad. Sci. USA . 93 (25): 14440–5. Bibcode :1996PNAS...9314440S. doi : 10.1073/pnas.93.25.14440 . PMC 26151 . PMID 8962070.
- ^ Wang W, Sun J, Nimtz M, Deckwer WD, Zeng AP (2003). 「質量分析データと生ゲノム配列の組み合わせによるKlebsiella pneumoniaeの2次元ゲル電気泳動分析からのタンパク質同定」。Proteome Science . 1 (1): 6. doi : 10.1186/1477-5956-1-6 . PMC 317362. PMID 14653859 .
- ^ Henzel, William J.; Watanabe, Colin; Stults, John T. (2003-09-01). 「タンパク質同定: ペプチド質量フィンガープリンティングの起源」. Journal of the American Society for Mass Spectrometry . 14 (9): 931–942. Bibcode :2003JASMS..14..931H. doi :10.1016/S1044-0305(03)00214-9. ISSN 1044-0305. PMID 12954162.
- ^ Matsudaira, P. (1987-07-25). 「ポリフッ化ビニリデン膜に電気ブロットしたピコモル単位のタンパク質の配列」The Journal of Biological Chemistry . 262 (21): 10035–10038. doi : 10.1016/S0021-9258(18)61070-1 . ISSN 0021-9258. PMID 3611052.
- ^ BC Orcutt、 DG George、Dayhoff、MO (1983)。「タンパク質および核酸配列データベースシステム」。生物物理学および生物工学年次レビュー。12 (1): 419–441。doi :10.1146/annurev.bb.12.060183.002223。PMID 6347043 。
- ^ Moore, RE; Licklider, L.; Schumann, D.; Lee, TD (1998-12-01). 「ペプチドおよびタンパク質のオンライン液体クロマトグラフィー/タンデム質量分析のためのモノリシックポリ(スチレン-ジビニルベンゼン)支持体を組み込んだマイクロスケールエレクトロスプレーインターフェース」。分析 化学。70 ( 23 ): 4879–4884。doi :10.1021/ac980723p。ISSN 0003-2700。PMID 9852776 。
- ^ ab Whitmore, Colin D.; Gennaro, Lynn A. (2012-06-01). 「治療用抗体のトリプシンペプチドマッピングのためのキャピラリー電気泳動-質量分析法」.電気泳動. 33 (11): 1550–1556. doi :10.1002/elps.201200066. ISSN 1522-2683. PMID 22736356. S2CID 28717319.
- ^ ティード、ベルント (2005)。 「ペプチドマスフィンガープリンティング」。メソッド。35 (3): 237–247。土井：10.1016/j.ymeth.2004.08.015。PMID 15722220。
- ^ Dass, Chhabil (2007).現代質量分析の基礎 | Wiley Online Books . doi :10.1002/0470118490. ISBN 9780470118498。